细菌学检验1分枝杆菌属课件

下页 退出 分枝杆菌属（Mycobacterium）总目录 上页 下页 退出 返回 内容提要 分枝杆菌属 分枝杆菌属概述 结核分枝杆菌 麻风分枝杆菌 微生物学检查 概述 生物学性状 致病性与免疫性 防治原则 概述 生物学性状 微生物学检查 致病性 防治原则 非结核分枝杆菌 总目录 上页 下页 退出 返回 分枝杆菌属概述?是一类细长微弯的细菌，因有分枝生长趋势而得名?特点 细胞壁含有大量的脂类（分枝菌酸）菌体不易着色，不易脱色，常采用抗酸染色，抗酸染色阳性（抗酸杆菌）营养要求高，生长缓慢 无特殊结构，不产毒素，其致病性与菌体成分有关 引起疾病都呈慢性，并伴肉芽肿 总目录 上页 下页 退出 返回 分枝杆菌属概述?分类分类 总目录 上页 下页 退出 返回 第一节 结核分枝杆菌（M.tuberculosis)一、概述一、概述 俗称结核杆菌(Tubercle bacilli，TB)，引起人类结核病有着三千年历史的古老疾病 目前，全球约有 1/3人口受结核杆菌感染，70%在亚洲。每年新发病例 800万，300万人死于结核病 结核病成为亟待解决的全球性公共卫生问题，是艾滋病高发区人群的首要死因 总目录 上页 下页 退出 返回 第一节 结核分枝杆菌（M.tuberculosis)一、概述一、概述 致病菌主要包括：人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌。人型结核分枝杆菌 感染的发病率最高 我国是世界上结核病负担最严重的 22个国家之一，每年25万死于结核，传染病之首 世界防治结核病日 3月24日 总目录 上页 下页 退出 返回 二、生物学性状?形态与染色形态与染色 细长略弯，分枝状 荚膜对菌体有一定的保护作用 抗酸染色阳性抗酸染色阳性，菌体呈红色，背景呈蓝色 总目录 上页 下页 退出 返回?金胺O染色：在荧光显微镜菌体呈橘黄色?L型菌：Much 颗粒，多见于细菌的变异 总目录 上页 下页 退出 返回 结核杆菌电镜图结核杆菌电镜图 总目录 上页 下页 退出 返回?培养特性培养特性 专性需氧，pH偏酸6.5-6.8 营养要求高，常用 罗琴氏培养基（选择性固体培养基，培养基所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长）生长缓慢，18h/代，2-4W可见菌落生长 菌落特征：乳白或米黄，表面 粗糙呈颗粒结节，边缘不整，呈“菜花样”菌落 液体培基：表面生长成菌膜 二、生物学性状 总目录 上页 下页 退出 返回 总目录 上页 下页 退出 返回 二、生物学性状?生化反应 不发酵糖类 触酶试验阳性 热触酶试验：将细菌悬液 6830min，再加过氧化氢?对区别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌有重要意义?结核分枝杆菌热触酶试验阴性 总目录 上页 下页 退出 返回?抵抗力 四怕：?对酒精敏感?对湿热敏感?对紫外线敏感?对抗结核药物（链霉素、异烟肼、利福平等）敏感，但易产生耐药性 二、生物学性状?抵抗力 四不怕：?耐干燥?耐酸碱?耐染料?对青霉素等抗生素耐药 总目录 上页 下页 退出 返回?变异性变异性 形态结构变异?在异烟肼、溶菌酶等作用下形成L型（多形性）菌落变异?R-S型变异，性状典型不典型，毒力减弱 毒力变异：?卡介苗BCG：Calmette和Gurin将牛分枝杆菌经13年230次传代而获得的减毒活疫苗株，用于预防结核病 耐药性变异?易发生，抗结核药物的结核菌株日益增多 二、生物学性状 总目录 上页 下页 退出 返回 三、致病性与免疫性?致病物质菌体成分菌体成分，机体免疫病理损伤 脂质存在细胞壁，含量与毒力平行?索状因子（糖脂-分枝菌酸+海藻糖）：破坏细胞，引起肉芽肿?磷脂：形成结核结节和干酪样坏死?蜡质D（分枝菌酸+肽糖脂）：引起迟发性过敏反应?硫酸脑苷脂：抑制吞噬体与溶酶体结合 总目录 上页 下页 退出 返回 三、致病性与免疫性?致病物质菌体成分菌体成分，机体免疫病理损伤 蛋白质?有抗原性、本身无毒，如结核菌素?蛋白质+蜡质D迟发型变态反应。组织坏死、全身中毒症状结核结节形成 荚膜 总目录 上页 下页 退出 返回?感染方式 多途径感染：呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入机体?所致疾病 结核病，疾病种类多样化，以 肺结核常见 三、致病性与免疫性 总目录 上页 下页 退出 返回?所致疾病 肺部感染：?原发感染:多发生于儿童 原发综合征：原发灶（肺泡渗出性炎症）、淋巴管炎和肿大的肺门淋巴结 纤维化和钙化而自愈 复发：内源性感染的来源 三、致病性与免疫性 总目录 上页 下页 退出 返回?所致疾病所致疾病 肺部感染：?继发感染:多发生于成人，内源性感染 病灶多局限，不累及邻近淋巴结 干酪样坏死和空洞，菌可随痰排出，开放性肺结核 三、致病性与免疫性 空洞 干酪样坏死 总目录 上页 下页 退出 返回?所致疾病所致疾病 肺外感染：肺外感染：?免疫力低下患者?常见于脑、肾、骨、关节、生殖系统。脑结核、肾结核、淋巴结核、皮肤结核等?痰菌被咽入消化道或食入了消毒不严格的牛奶也可引起肠结核、结核性腹膜炎等?少数形成全身粟粒性结核或播散性结核 三、致病性与免疫性 总目录 上页 下页 退出 返回?免疫性传染、免疫、超敏反应共存 人体对该菌有较强免疫力（感染率高，发病率低）主要是细胞免疫，有菌免疫 细胞免疫与迟发型超敏反应同时存在 三、致病性与免疫性 总目录 上页 下页 退出 返回?免疫性免疫性 结核菌素试验（Tuberculin test)（OT试验）?原理：是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起迟发型超敏反应的一种试验，以判断机体对结核有无免疫力?试剂：旧结核菌素（OT）-主要成分是结核杆菌蛋白 纯蛋白衍生物（PPD）?方法：前臂皮内注射OT 或PPD5单位，48-72h后观察 三、致病性与免疫性 总目录 上页 下页 退出 返回?免疫性 结核菌素试验（Tuberculin test)（OT试验）?结果：阳性：红肿硬结直径5mm，表明曾感染过结核杆菌/接种BCG 强阳性：直径15mm，表明可能有活动性结核 阴性：直径5mm，表明无结核感染，但应排除原发感染的早期、老年人、严重结核患者或同时患有其它传染病、获得性免疫功能低下等情况 三、致病性与免疫性 总目录 上页 下页 退出 返回?免疫性 结核菌素试验（Tuberculin test)（OT试验）?应用：选择卡介苗接种对象、测定卡介苗接种后的免疫效果 了解人群自然感染率 作为婴幼儿结核病的辅助诊断 测定肿瘤患者的细胞免疫功能 三、致病性与免疫性 总目录 上页 下页 退出 返回 总目录 上页 下页 退出 返回 四、微生物学检查 总目录 上页 下页 退出 返回 总目录 上页 下页 退出 返回 四、微生物学检查?标本采集标本采集 清晨第一口痰送检 无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送检 脑脊液标本静置后，表面有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养 采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物 总目录 上页 下页 退出 返回 四、微生物学检查四、微生物学检查?检验方法检验方法 直接涂片染色镜检：常用的简易快速检查方法?齐-尼抗酸染色：痰涂片要厚，观察至少 100个视野。结核分枝杆菌抗酸染色后呈红色，其他细菌和细胞为蓝色?金胺O染色：荧光显微镜下见金黄色荧光的结核分枝杆菌，结果快速准确 结果应报告“找到或未找到抗酸性杆菌”，而不能报告“找到结核分枝杆菌”总目录 上页 下页 退出 返回?齐-尼抗酸染色结果报告方式 总目录 上页 下页 退出 返回 四、微生物学检查?检验方法检验方法 核酸检测?用PCR法快速诊断结核分枝杆菌感染?特异性与敏感性均大于95 抗PPDIgG的检测?ELISA法检测患者血清中抗PPDIgG?可作为活动性结核分枝杆菌感染的快速诊断方法，阳性率为8090 总目录 上页 下页 退出 返回 四、微生物学检查?检验方法检验方法 分离培养分离培养?无杂菌污染的标本：脑脊液、胸腹水等可直接或离心后取沉渣接种?有杂菌污染的标本在接种到培养基之前须做 4%NaOH处理15min，以消除杂菌的干扰?标本接种于罗琴培养基。37，510CO2培养8周，如果出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落，涂片染色为抗酸阳性，多数是结核分枝杆菌。阴性继续培养至12周方可报告 总目录 上页 下页 退出 返回?检验方法检验方法 总目录 上页 下页 退出 返回 总目录 上页 下页 退出 返回 总目录 上页 下页 退出 返回 总目录 上页 下页 退出 返回 总目录 上页 下页 退出 返回 四、微生物学检查?检验方法检验方法 菌种鉴定：可为结核病和非典型分枝杆菌菌种鉴定：可为结核病和非典型分枝杆菌病的临床鉴别和防治提供科学的依据病的临床鉴别和防治提供科学的依据?PCR反向膜探针杂交EHSA法(PCR杂交梳)?DNA探针?16s rRNA基因序列测定?高效液相色谱(HPLC)检测 总目录 上页 下页 退出 返回 四、微生物学检查?检验方法检验方法 动物接种动物接种?可用于结核分枝杆菌的分离和毒力测定?此法敏感可靠，但手续较繁琐，不能列为常规?常用的豚鼠?在接种后3-4周出现局部淋巴结肿大，身体消瘦，结核菌素试验转为阳性?剖检时可看到淋巴结、肝、脾、肾、肺等脏器的典型结核病变，由病变处可查到抗酸杆菌或经培养有结核分枝杆菌生长 总目录 上页 下页 退出 返回 四、微生物学检查?检验方法检验方法 药物敏感性试验药物敏感性试验?耐药株的增多，应做药物敏感性试验，以指导临床合理用药。?将纯培养物菌悬液，接种含各种浓度药物的固体培养基（改良罗氏培养基）上，同时做不含药物的对照组?常用方法：绝对浓度法（间接法）、比率法 总目录 上页 下页 退出 返回 药物敏感性试验绝对浓度法（间接法）我国30多年来一直沿用的常规药敏试验方法。1.菌悬液制备：（1）临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长2周），初生长2周后和贮存培养物须在改良罗氏培养基上二次传代，取23周的亚培养物进行试验。（2）菌悬液制备：取上述培养物（需刮取斜面各个部分）放玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动使呈乳酪样，以0.5%吐温-80生理盐水磨菌稀释，与标准麦氏比浊管比浊配成1mg/ml的菌悬液。总目录 上页 下页 退出 返回 药物敏感性试验绝对浓度法（间接法）2.含药培养基制备：改良罗氏培养基每100ml加入1ml抗结核稀释药液，制成含不同药物尝试的培养基斜面备用。3.接种：将制备的菌悬液10倍稀释至10-2mg/ml，以灭菌吸管准确吸取菌液 0.1ml分别接种于含药培养基和对照培养基斜面上，每管接种菌量为 10-3mg/ml。置37培养四周观察结果。总目录 上页 下页 退出 返回 药物敏感性试验绝对浓度法（间接法）4.菌落生长情况：同分离培养（以-、+、24+）。5.药敏结果判断：低浓度含药培养基分枝杆菌未生长者报告敏感（S），生长（1+）以上者报告耐药（R）。6.质量控制：每批试验应以结核分枝杆菌参考菌株（H37Rv敏感株）10-3 mg/ml检测含药培养基质量。要求对照培养基菌落数在 200个以上且无融合，若菌落数低于50个时，要求重新作药敏试验。总目录 上页 下页 退出 返回 药物敏感性试验?比例法：是世界卫生组织（WHO）全球结核病耐药监测项目统一推荐的方法。1.培养基制备：同上述绝对浓度法。培养基药物中药物终浓度为：异烟肼0.2mg/ml，双氢链霉素4mg/ml，利福平40mg/ml，乙胺丁醇2mg/ml。2.菌液：新鲜菌落制成1.0mg/ml菌悬液，依次稀释至10-2和10-4 mg/ml。3.接种：分别接种10-2和10-4 mg/ml菌液0.01ml至对照及含药培养基斜面。4.培养：37培养4周 总目录 上页 下页 退出 返回 药物敏感性试验?比例法：比例法：5.结果的判读、解释和报告：计算耐药百分比，即含药培养基上菌落数与无药培养基上菌落数相比的百分比。?耐药百分比(含药培养基上菌落数)/(对照培养基上菌落数)100%)。?1%者报告敏感（S），1%者报告耐药（R）。总目录 上页 下页 退出 返回 总目录 上页 下页 退出 返回 五、防治原则?预防：一般性预防：卫生宣传、提高机体抵抗力 特异性预防：?发现和治疗痰菌阳性者?新生儿和结核菌素试验阴性的儿童接种卡介苗?治疗：一般治疗：合理营养，注意休息 抗结核药物链霉素、异烟肼、利福平等?治疗原则：早期、联合、适量、规律、分阶段治疗和坚持全程 总目录 上页 下页 退出 返回 第二节 非典型分枝杆菌 是指结核和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。因具有抗酸性，故又称非典型抗酸性菌。广泛分布于外环境和人及动物的机体中。已发现 17种以上能引起人类疾病，引起的肺部感 染,又难以与结核分枝杆菌感染区别，并对常用抗生素和抗结核药物耐药，所以区分鉴 别非典型分枝杆菌具有重要的意义。总目录 上页 下页 退出 返回 一、光产色分枝杆菌一、光产色分枝杆菌?特点是在暗处不产生色素，光照 1h后能在48h内，菌落转为黄色或橘黄色。?对人有致病性的是：堪萨斯分枝杆菌：广泛分布于水和土壤中,能引起肺内外结核样的病变。海分枝杆菌：为水中的腐生菌。通过皮肤微小创口侵入，引起所谓的“游泳池肉芽肿”。猿分枝杆菌：先后从猿和人体分离出此菌。总目录 上页 下页 退出 返回 二、暗产色分枝杆菌?有光或无光均能产生色素，呈黄色或橘黄色。?对人有致病性的为：瘰痢分枝杆菌：25-37均可生长，35最为适宜，45则不能生长。可引起人淋巴结炎或肺部感染。苏尔加分枝杆菌：37时为暗产色，25时为光产色。本菌引起成人肺部的慢性感染。总目录 上页 下页 退出 返回 三、不产色分枝杆菌?不能产生色素。对人有致病性的是：鸟-胞内复合分枝杆菌(MAC/MAIC)：AIDS患者易感染，对抗结核药物不敏感或产生耐药。溃疡分枝杆菌：通过创伤感染，四肢伸侧形成无痛性溃疡，缓慢愈合或出现继发感染。蟾分枝杆菌：为蟾蜍肉芽肿的病原菌。多引起老年男性的慢性肺部感染。总目录 上页 下页 退出 返回 四、迅速生长分枝杆菌?在普通培养基上生长速度快，生长温度为25-45，对人有致病性的是：偶发分枝杆菌：可引起人局部或肺部感染，对现有的抗结核药物均有耐药性。龟分枝杆菌：可引起人的软组织病变及手术后继发感染，亦可引起肺部感染。总目录 上页 下页 退出 返回 非结核分枝杆菌检验程序 总目录 上页 下页 退出 返回 第三节 麻风分枝杆菌（M.leprae）一、概述一、概述 俗称麻风杆菌，引起 麻风病，是一种慢性传染病 流行广泛，主要分布在亚、非和拉丁美洲 总目录 上页 下页 退出 返回 二、生物学性状?形态与染色形态与染色 其大小、形态、染色均与结核杆菌类似，但菌体略粗 抗酸染色阳性，呈束状或团状排列 典型的胞内寄生菌。多存在于细胞内麻风细胞（有大量麻风杆菌存在的感染细胞，呈泡沫状）总目录 上页 下页 退出 返回?培养特性培养特性 目前体外人工培养目前体外人工培养尚未成功 动物模型：动物模型：犰狳，对该菌高度易感，接种后引起瘤型麻，对该菌高度易感，接种后引起瘤型麻风。人对该菌抵抗力强，接触者仅少数发病风。人对该菌抵抗力强，接触者仅少数发病 二、生物学性状 总目录 上页 下页 退出 返回 三、致病性?所致疾病所致疾病 麻风病，是一种慢性传染病，主要表现为皮肤、粘膜和神经末梢 的损害，晚期可侵犯深部组织和器官，形成肉芽肿 人类为唯一宿主和唯一传染源，致病因素不清 总目录 上页 下页 退出 返回 三、致病性?所致疾病所致疾病 传染源：病人（瘤型麻风病人通过皮肤黏膜及外分泌液向外排菌）。传播途径：皮肤、黏膜、呼吸道及密切接触 潜伏期：2-5年，长者数十年 特点：潜伏期长，发病慢，病程长的慢性传染病 类型：瘤型麻风（麻风结节，“狮面容”），结核样型，界线类，未定类 总目录 上页 下页 退出 返回 三、致病性?所致疾病所致疾病 瘤型麻风（麻风结节，瘤型麻风（麻风结节，“狮面容狮面容”）?肉芽肿，麻风结节 总目录 上页 下页 退出 返回 总目录 上页 下页 退出 返回 三、致病性?所致疾病所致疾病 结核样型麻风结核样型麻风?皮肤边缘清楚的红色斑疹?感觉功能障碍 总目录 上页 下页 退出 返回 总目录 上页 下页 退出 返回 麻风杆菌侵犯神经系统麻风杆菌侵犯神经系统 总目录 上页 下页 退出 返回 四、微生物学检查?显微镜检查显微镜检查 可从患者鼻粘膜或皮损处取材，用抗酸性染色后检查 一般瘤型和界线类患者标本中可找到细菌在细一般瘤型和界线类患者标本中可找到细菌在细胞内存在，有诊断意义?PCR 总目录 上页 下页 退出 返回 五、防治原则?无特异性预防方法，隔离?早期发现、早治疗?目前多采用二三种药联合治疗 氨苯砜（dapsone，DDS）