植物生理学实验-叶绿体色素的定量测定

植物生理学实验植物生理学实验 叶绿素类胡萝卜素叶绿素a叶绿素b叶黄素胡萝卜素植物生理学实验植物生理学实验植物生理学实验植物生理学实验胡萝卜素 该方法由该方法由Anorn于于1949年建立。根据叶绿年建立。根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，用公式计算计在某一特定波长下测定其光密度，用公式计算出提取液中各色素的含量。出提取液中各色素的含量。根据根据朗伯朗伯-比尔比尔 定律，某有色溶液的光密度定律，某有色溶液的光密度D与其中溶质浓度与其中溶质浓度C和液层厚度和液层厚度L成正比，即：成正比，即：式中：式中：k为比例常数。为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为度为1cm时，时，k为该物质的比吸收系数。各种为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得：光密度而求得：将叶绿体色素利用纸上色层分离方法得到将叶绿体色素利用纸上色层分离方法得到的各种色素（单一纯度的），配成已知浓度的的各种色素（单一纯度的），配成已知浓度的溶液，测定不同波长下的溶液，测定不同波长下的D，就可以计算，就可以计算k值。值。植物生理学实验植物生理学实验 植物生理学实验植物生理学实验 叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异。在使用不同溶剂提取色素时，谱有差异。在使用不同溶剂提取色素时，计算公式有所不同。计算公式有所不同。本实验以本实验以 96乙醇为例。植物生理学实验植物生理学实验 96乙醇提取乙醇提取 Cxc(mg/L)=(1000D4702.05Ca114.8Cb)/245植物生理学实验植物生理学实验 叶绿素叶绿素a、b的的80%丙酮提取液在红光区的丙酮提取液在红光区的最大吸收峰：最大吸收峰：663nm和和645nm 663nm下，叶绿素下，叶绿素a、b的比吸收系数：的比吸收系数：Ka66382.04 Kb663 645nm下，叶绿素下，叶绿素a、b的比吸收系数：的比吸收系数：Ka645 16.75 Kb645 80丙酮提取丙酮提取根据加和性原则列出以下关系式：根据加和性原则列出以下关系式：D663 D645 解方程组得：解方程组得：663645 Cb645663 Ca与与Cb相加即得叶绿素总量（相加即得叶绿素总量（CT）：）：CT(mg/L)=Ca+Cb645663 植物生理学实验植物生理学实验 由于叶绿素由于叶绿素a、b在在652nm的吸收峰的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为），相交，两者有相同的比吸收系数（均为），也可以在此波长下测定一次光密度（也可以在此波长下测定一次光密度（D652）而求出叶绿素而求出叶绿素a、b总量：总量：CT(mg/L)=(D652 植物生理学实验植物生理学实验 在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。80%丙酮丙酮提取液中三种色素含量的计算公式提取液中三种色素含量的计算公式：Ca(mg/L)=12.21D663 2.81D646 CbCxc(mg/L)=(1000D4703.27Ca104Cb)/229 植物生理学实验植物生理学实验三、实验材料：菠菜叶片菠菜叶片 材料分材料分：新生叶（幼叶），功能叶新生叶（幼叶），功能叶 ；一组测定幼叶，一组测定幼叶，一组测定功能叶。一组测定功能叶。四、操作步骤程序：1 1、样品提取；、样品提取；2 2、比色测定、比色测定 3 3、了解、了解CL-01CL-01叶绿素仪叶绿素仪 1、样品提取步骤将组织表面擦净，剪碎于培养皿内混匀将组织表面擦净，剪碎于培养皿内混匀称取剪碎样品称取剪碎样品g g，共，共3 3份份加少量石英砂，少许碳酸钙粉，加少量石英砂，少许碳酸钙粉，加加1 12 2滴管滴管96%96%乙醇研成匀浆乙醇研成匀浆再加约再加约5ml5ml乙醇研磨至组织变白，乙醇研磨至组织变白，静置静置1 13min3min过滤到过滤到25ml25ml棕色棕色容量瓶中，容量瓶中，残渣冲洗数次残渣冲洗数次转移时防止倒在滤纸与漏转移时防止倒在滤纸与漏斗中间，否则溶液浑浊。斗中间，否则溶液浑浊。混浊不能比色，重滤混浊不能比色，重滤!碳酸钙要少，多则过碳酸钙要少，多则过滤慢，滤慢，提取液浑浊提取液浑浊无损转移无损转移始终防止容量瓶倾倒始终防止容量瓶倾倒!植物生理学实验植物生理学实验波长调节旋钮波长调节旋钮样品室样品室显示屏显示屏功能键功能键测定溶液加到测定溶液加到比色杯的比色杯的2/3初初空白对准光路空白对准光路透射比透射比调零键调零键开盖开盖空白对在空白对在光路上光路上调调100按钮按钮合上比色池的盖合上比色池的盖调模式至吸光度调模式至吸光度选择需要的波长选择需要的波长按按“模式模式”键，调到键，调到“投射比投射比”打开样品仓盖，按打开样品仓盖，按“0”键调零键调零合上仓盖，按合上仓盖，按“100”键调满度键调满度100按按“模式模式”键，调到键，调到“吸光度吸光度”打开样品仓盖，在最外侧杯室中打开样品仓盖，在最外侧杯室中放入空白液的比色杯，合上仓盖放入空白液的比色杯，合上仓盖按按“100”键调空白吸光值为零键调空白吸光值为零其它杯室中放入待测溶液，合上仓盖其它杯室中放入待测溶液，合上仓盖,拉动拉杆依次测定各待测液的吸光值拉动拉杆依次测定各待测液的吸光值 测定日期：测定日期：