酶活性测定的基本知识精

职业教育医学检验技术专业教学资源库生物化学检验永州职业技术学院 欧陵斌酶活性测定的基本知识Company name第一节 酶活性测定的基本知识 酶是一种生物催化剂，其化学本质酶是一种生物催化剂，其化学本质是蛋白质。它在体内含量极微，每是蛋白质。它在体内含量极微，每mlml仅为仅为pgpg水平，要直接测定其绝对量是十分困难水平，要直接测定其绝对量是十分困难的，目前是根据其催化反应速度来定量，的，目前是根据其催化反应速度来定量，称为相对定量法。称为相对定量法。Company name（一）酶的结构和分类 酶酶单纯酶单纯酶结合酶结合酶辅酶辅酶辅基辅基分类：根据酶所催化的反应类型将酶分为氧化还原酶、分类：根据酶所催化的反应类型将酶分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和合成酶六大类。转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和合成酶六大类。Company name（二）酶的系统命名酶的系统命名法(又称EC命名法)：即每种酶用四个数字加以系统编号。数字前冠以EC，数字之间用黑点隔开。第一个数字表示酶的类别，第二个表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个表示酶的编号序数。如：乳酸脱氢酶属于第1大类，第1亚类，第1亚-亚类，在第1亚-亚类中的编号为27，故此酶的专有编号为EC1.1.127 Company name（三）、酶活性的概念（三）、酶活性的概念 1 1、酶活性酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。位时间内底物的减少量或产物的生成量。底物浓度为底物浓度为S S,产物浓度为产物浓度为P P,时间为时间为t t，反应速度为，反应速度为v vv=-dv=-dS S/dt/dt 或或 v=dv=dP P/dt/dt。注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。生成量为好。Company name2 2、酶活性单位、酶活性单位n定义：定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。准。惯用单位惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。酶活性测定方法的建立者所规定的单位。国际单位国际单位：1IU指在规定条件（最适指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，最适底物浓度）下，每分钟转化每分钟转化1 mol底物的酶量。单位为底物的酶量。单位为IU/L。Katal单位单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的底物的酶量，酶量，1Katal=60106IU。Company name3 3、酶活性单位的计算、酶活性单位的计算n步骤：步骤：运用公式进行计算。运用公式进行计算。明确测定方法的明确测定方法的酶单位定义酶单位定义，按照酶单位，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位，定义确定物质量、体积和时间的单位，Company namen计算公式计算公式:产物的增加量产物的增加量 每单位规定的保温时间每单位规定的保温时间 10001000（mlml）酶单位酶单位/升升 =每单位规定的产物增加量每单位规定的产物增加量 实际保温时间实际保温时间 实际标本用量（实际标本用量（mlml）分光光度法测定的公式：分光光度法测定的公式：（A A测定测定 A A对照）对照）V V总总10106 6 每单位规定的保温时每单位规定的保温时间间酶单位酶单位/升升 =L LV V标本标本 实际保温时间实际保温时间Company name4 4、酶促反应进程、酶促反应进程n 酶促反应进程曲线酶促反应进程曲线 Company name从酶促反应时间进程曲线可以看出，酶促反应的各期具有以下特点：1.延滞期延滞期 对单一酶促反应而言，在过量的底物存在下，底对单一酶促反应而言，在过量的底物存在下，底物与酶结合启动酶促反应。物与酶结合启动酶促反应。2.线性期线性期 指酶促反应速度达到并保持恒定速度进行反应的指酶促反应速度达到并保持恒定速度进行反应的时期。此时，反应速度不受底物浓度的影响，又称零级反时期。此时，反应速度不受底物浓度的影响，又称零级反应期。此期酶活性与酶促反应速度成正比。应期。此期酶活性与酶促反应速度成正比。3.非线性期非线性期 随着反应时间的延长，底物消耗越来越明显，随着反应时间的延长，底物消耗越来越明显，酶促反应速度明显下降，偏离线性期而进入非线性期。酶促反应速度明显下降，偏离线性期而进入非线性期。Company namen酶量的测定：酶量的测定：通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量，应使酶浓度（确测定酶量，应使酶浓度（E E）与酶促反应速度）与酶促反应速度成正比，即成正比，即E E-d-dS S/dt/dt或或E EddP P/dt/dt。能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。度，即酶促反应初速度。酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。应速度才能准确代表酶活性。酶的含量酶的含量 酶活性酶活性酶促反应初速度酶促反应初速度Company name5 5、酶促反应底物动力学、酶促反应底物动力学n中间产物学说：中间产物学说：酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催化底物反应生成产物。化底物反应生成产物。E+S E+S ES E+P ES E+P Company namen米米-曼氏方程：曼氏方程：Vmax VmaxS Sv=v=S S+Km+Km 上式中上式中v v代表反应速度，代表反应速度，VmaxVmax代表最大反应速度，代表最大反应速度，S S代表底物浓度，代表底物浓度，KmKm称为米氏常数。称为米氏常数。Company name（一）米氏常数的定义（一）米氏常数的定义由米由米-曼氏方程可以导出：曼氏方程可以导出：（Vmax-vVmax-v）S SKm=Km=v v 当当v=1/2Vmaxv=1/2Vmax时，时，Km=Km=S S。因此。因此KmKm值为反应速度相当于值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度。最大反应速度一半时的底物浓度。KmKm值是酶的特征常数值是酶的特征常数，具有重，具有重要的应用价值。要的应用价值。Company name（二）（二）KmKm值的应用值的应用1.1.鉴定酶的种类鉴定酶的种类 KmKm值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种不同种类的酶其类的酶其KmKm值不同，对于一种未知的酶，可在规定的值不同，对于一种未知的酶，可在规定的条件下测定其条件下测定其KmKm值加以鉴定。值加以鉴定。Company name表表7-1 7-1 某些酶的某些酶的KmKm值值 酶酶 底物底物 Km(mmol/L)Km(mmol/L)乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 丙酮酸丙酮酸 0.0170.017己糖激酶己糖激酶 D-D-葡萄糖葡萄糖 0.050.05 D-D-果糖果糖 1.51.5-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 D-D-乳糖乳糖 4.04.0碳酸酐酶碳酸酐酶 H2CO3 H2CO3 9.09.0过氧化氢酶过氧化氢酶 H2O2 H2O2 2525蔗糖酶蔗糖酶 蔗糖蔗糖 2828糜蛋白酶糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸甘氨酰酪氨酰甘氨酸 108108Company name2.2.反映酶与底物的亲合力反映酶与底物的亲合力 KmKm值越大，酶与底物亲合力越小，值越大，酶与底物亲合力越小，KmKm值越小，酶与底物亲合力越大。值越小，酶与底物亲合力越大。3.3.选择酶的最适底物选择酶的最适底物 Km Km值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底物有不同的物有不同的KmKm值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，使酶促反应容易进行，并节省底物用量。使酶促反应容易进行，并节省底物用量。Company name4.4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的比率大反应速度的比率 根据米根据米-曼氏方程可以计算曼氏方程可以计算 5.5.设计适宜的底物浓度设计适宜的底物浓度 酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的活性，一般要求初速度达到最大速度的90%90%95%95%、底物、底物消耗率为消耗率为1%1%5%5%。这样既可以近似地表示酶活性，又不。这样既可以近似地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪费。致于使底物浓度过高而造成浪费。Company name(三三)V)Vmaxmax的应用的应用n定义定义 ：Vmax指指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。酶完全被底物分子饱和时的反应速度。n应用：应用：Vmax可用来计算酶的转化率（可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子），即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。当反秒。当反应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的转化率：转化率：TN=底物转化量（底物转化量（mol/s）/酶量（酶量（mol）Company name(四四)K)Km m和和V Vmaxmax的测定的测定1 1Linweaver-BurkLinweaver-Burk作图法作图法,又称为双倒数作图法又称为双倒数作图法 1 Km+1 Km+S S Km 1 1 Km 1 1 =+=+v Vmax v VmaxS S Vmax Vmax S S Vmax VmaxCompany name(五)酶促反应影响因素及反应条件的选择影响酶促反应的因素主要有底物浓度底物浓度、酶浓度酶浓度、温度温度、pHpH、抑制剂抑制剂、辅因子和激活剂辅因子和激活剂等 1.1.底物浓度底物浓度 当底物浓度当底物浓度SKmSKm，米，米-曼氏方程中的曼氏方程中的KmKm可可以忽略不计，此时以忽略不计，此时VVmaxVVmax，反应速度达最大速度，反应速，反应速度达最大速度，反应速度与酶浓度成正比。根据米度与酶浓度成正比。根据米-曼氏方程，一般酶活性测定时曼氏方程，一般酶活性测定时底物浓度最好为底物浓度最好为KmKm的的10201020倍，初速度可达最大速度的倍，初速度可达最大速度的90%95%90%95%。2.2.酶浓度酶浓度 按照中间产物学说，只有按照中间产物学说，只有SESE时，酶才能被时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。3.3.温度温度 多数酶的最适温度在多数酶的最适温度在37403740，高于或低于最适温，高于或低于最适温度，酶活性都降低。度，酶活性都降低。4.pH pH4.pH pH过高或过低均可导致酶活性下降。一般来说，血过高或过低均可导致酶活性下降。一般来说，血清中大多数酶最适清中大多数酶最适pHpH在在6.56.58.08.0之间。之间。