race技术原理和操作

RACE (rapid amplification of cDNA ends)技术的原理和操作近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技 术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。 但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技 术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中 快速扩增cDNA的5和3末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的 重视。经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技 术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA 5和3端，包括单边PCR和锚定PCR。该 技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman 等，1995： Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova 等，1998： Matz 等 11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物(lock docking primer)合成第一链cDNA，即在oligo(dT) 引物的 3端引入两个简并的核苷酸5-Oligo(dT)1(-30MN-3，M=A/G/C； N=A/G/C/T, 使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT )与poly(A) 尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5端加尾时，采用poly(C),而不是poly(A)；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA 聚合酶可能在高温(6oC7OC )有效地逆转录mRNA,从而消除了 5端由于高CC含量 导致的mRNA二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR (touch down PCR) 提高PCR反应的特异性。随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的 MarathoTM技术和SMARTTM RACE技术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒 进行RACE反应，结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用SMARTTM RACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到 mRNA的5末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTM RACE试剂盒。以下 就国内目前应用最广的SMARTTM RACE试剂盒为例，简要概述RACE技术的原理和操作 过程。SMARTTM 3-RACE 原理利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷 酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后 用一个基因特异引物GSPi(gene specific primer，GSP)作为上游引物，用一个含有部分 接头序列的通用引物UPM(universal primer，UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为 模板，进行PCR循环，把目的基因3末端的DNA片段扩增出来。(见下图)www* bioask*cnpdvA+ RNA J-3WCTTTTTs=rarSRACE-ReadcDNAIh TTTTTm-J-wwu + bioaskH cnVT-UWWWWWiWWiWiViWWWJRW貼 L-MTTTTTatSlandardfira-t-Eitrand tfntlretia- BD SMAR1IIA seqienc&外RACE PCRFirat round of PCR一 吗翎腑rj迈霍匚nNaxt rounds of PCRIncorpuration of suppression PCR inverted即Bat GlemeffU. = byLong Uni価跑I PrimertJBAAMAqI- 丁uuu* bi oask* cnReniaining rounds of PCRAmplificafion cf 3 fragiirt&nt1* i Il, rouble-strandsd 3-RA.CE fragmentUhJbl. bSMARTTM 5-RACE 原理先利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)3oMN 作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶 具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火 后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART 序列为模板继续延伸而连上通用接头(见下图)。然后用一个含有部分接头序列的通用引物 UPM(universal primer，UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物 2 (GSP 2 genespecific primer，GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的 基因5末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的37 5-RACE产物中获得全长cDNA,或者通过分析 RACE产物的3和5端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。RF lemplale switchingAD SMART firat-trand s*jrn1hasi&SRftCE-R&ady cDNA51 RACE PCRKTTTTTflnhuuui, bioask .rround ofPCR rporstion of suppr8&n PCR iiThrtod repeat olgnwirts: ii try Long 11伽倒1 Primerj-1LT (l讦 ItJ/TTTT7r=-s-Second round of PCRGencific 钟nth 卿为uuuj * bi oask. cnRemaining rounds PCR Amplrficabon of 51 fragment已知序列AAAAAAAA实验中发现，做RACE反应实验实际操作中仍存在不少困难。因此，对RACE反应条件进 行反复摸索是十分必要的。这是因为：1. 在5-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PCR扩增)，每 一步都可能导致失败；2. 扩增DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品的不均一性，因而特异 性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用RACE技术扩增得到的 特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除RACE实验结果中扩增产物假阳 性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。随着RACE的不断改进和完善，优化条件下PCR扩增效率和忠实性的提高及PCR产 物克隆技术的迅速发展，RACE必将在基因克隆及基因表达研究中发挥越来越大的作用。RACE的另一种代表方法SelfLigation 法反转录(RT)反应Hybrid RNA的分解单链cDNA的自身连接PCR扩增5未知区域目的DNA片段的切胶回收DNA序列测定(ijww bioaskcn伽核 mRNAr未知医Sir$ 1 st PCJRPTtri PCR ftrifTifirt