苯硫脲尝味遗传大实验课堂PPT

LOGO遗传学大实验注意事项遗传学大实验注意事项1实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询。结果等，以备查询。2对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器）。在操作的过程中发现任何意外的现是微量移液器）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。象都要及时向任课教师汇报。3在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！特别（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。4.实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验室。目，向教师汇报征得同意后方可离开实验室。1.实验目的实验目的（1）测定人群中）测定人群中PTC 尝味基因的表现型和基因型，理尝味基因的表现型和基因型，理解孟德尔遗传基因型与表现型的对应关系。解孟德尔遗传基因型与表现型的对应关系。（2）了解酶切扩增多态序列（）了解酶切扩增多态序列（cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）（又称为（又称为PCR-RFLP）技术的原理，学会用）技术的原理，学会用CAPS 技术技术检测单核苷酸多态性检测单核苷酸多态性（SNPs）。在分子水平上测定）。在分子水平上测定PTC 尝味的基因型。尝味的基因型。（3）计算群体中）计算群体中PTC 尝味的基因频率，判断群体是否尝味的基因频率，判断群体是否达到达到Hardy-weiberg 平衡。平衡。2.实验原理实验原理2.1 苯硫脲尝味的遗传形式苯硫脲尝味的遗传形式 苯硫脲（苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）是硫脲的）是硫脲的 苯基衍苯基衍生物（图生物（图2.1），为白色结晶粉末，因含有硫代酰胺基），为白色结晶粉末，因含有硫代酰胺基（N-C=S）官能团而有苦涩味。能尝）官能团而有苦涩味。能尝1/750,0001/50,000 PTC 浓度溶液味道的人（苦涩味，少数人感到甜味）称浓度溶液味道的人（苦涩味，少数人感到甜味）称为苯硫脲为苯硫脲“尝味者（尝味者（taster）”；只能尝出；只能尝出PTC 浓度大于浓度大于1/24,000 溶液的味道（甚至对溶液的味道（甚至对PTC 的结晶物也尝不出苦的结晶物也尝不出苦味）的人称为苯硫脲味）的人称为苯硫脲“味盲者（味盲者（nontaster）”。 PTC 尝味能力是受单基因控制的孟德尔遗传尝味能力是受单基因控制的孟德尔遗传性状，是由位于性状，是由位于7 号染色体上（号染色体上（7q35-7q36）的）的一种苦味味觉感受器基因一种苦味味觉感受器基因TAS2R38 决定的，属决定的，属于常染色体不完全显性遗传。尝味者中显性基因于常染色体不完全显性遗传。尝味者中显性基因T的纯合子的纯合子(TT)能尝出能尝出1750,000 16,000,000的的PTC 溶液的苦味，杂合子溶液的苦味，杂合子(Tt)只能尝出只能尝出1480,000l380,000 的的PTC 溶液的苦味。因此溶液的苦味。因此可以利用对可以利用对PTC 的尝味能力测定家族中的基因传的尝味能力测定家族中的基因传递和人群中的基因频率。递和人群中的基因频率。2.2 人类苯硫脲尝味的基因人类苯硫脲尝味的基因 人类的人类的 PTC 尝味基因尝味基因Homo sapiens taste receptor,type 2,member38(TAS2R38)(NM_176817)，又名，又名PTC、T2R38 或或 T2R61。绝大多数尝味者与味盲者的区别。绝大多数尝味者与味盲者的区别在于三处单核苷酸多态性（在于三处单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs)： 第一处：第一处：145 位，味盲者为位，味盲者为G145（编码丙氨酸（编码丙氨酸ala），尝味者为），尝味者为C145（编（编码脯氨酸码脯氨酸pro）；）；第二处：第二处：785 位，味盲者为位，味盲者为T785（编（编码缬氨酸码缬氨酸val），尝味者为），尝味者为C785（编码丙（编码丙氨酸氨酸ala）；）；第三处：第三处：886 位，味盲者为位，味盲者为A886（编（编码异亮氨酸码异亮氨酸ile），尝味者为），尝味者为G886（码缬（码缬氨酸氨酸val）。）。 因此味盲者因此味盲者PTC 多肽中三处对应的氨多肽中三处对应的氨基酸分别是基酸分别是ala49、val262 和和ile262，被称，被称为为AVI 等位基因，而尝味者的三处是等位基因，而尝味者的三处是pro49、ala262 和和val262，被称为，被称为PAV 等位基因等位基因（图（图2.2，2.3）。）。图 2.2 味盲者PTC 尝味基因编码区（CDS）序列图2.3 味盲者PTC 多肽 味盲者的味盲者的PTC 编码区有五个限制性内切编码区有五个限制性内切Fnu4H1 的识别位点（识别序列的识别位点（识别序列5-GCNGC-3），如果是尝味者，则其第），如果是尝味者，则其第785 位位SNP 恰好恰好形成了一个额外的形成了一个额外的Fnu4H1 识别位（识别位（GCTGC）。）。因此可以利用这个因此可以利用这个SNP 造成的限制性位点多态造成的限制性位点多态性，设计引物扩增包含性，设计引物扩增包含785 位位SNP 位点的位点的PTC 基因编码区的一部分，然后用基因编码区的一部分，然后用Fnu4H1切割扩增切割扩增产物，根据是否能把扩增产物切开而判定是某产物，根据是否能把扩增产物切开而判定是某个人的单倍型（个人的单倍型（haplotype）。）。4.实验步骤实验步骤 （1）讲解实验目的、实验原理、实验技术路线。）讲解实验目的、实验原理、实验技术路线。（2）讲解口腔上皮细胞总）讲解口腔上皮细胞总DNA 的快速提取、基因的快速提取、基因PCR 扩扩增、增、DNA 电泳、电泳、PCR 产物纯化、产物纯化、DNA 酶切、遗传学分析等实验方法及注意事酶切、遗传学分析等实验方法及注意事项。项。（3）讲解高压蒸气灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、）讲解高压蒸气灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、电泳仪、水平电泳槽、涡旋振荡器、磁力搅拌器、电子天电泳仪、水平电泳槽、涡旋振荡器、磁力搅拌器、电子天平、平、PCR 仪、微波炉、紫外分光光度计、电磁炉、恒温仪、微波炉、紫外分光光度计、电磁炉、恒温水浴锅、恒温干热议、凝胶成像仪、制冰机、超净工作台、水浴锅、恒温干热议、凝胶成像仪、制冰机、超净工作台、通风橱、恒温振荡摇床、通风橱、恒温振荡摇床、37培养箱、培养箱、pH 计、微量移液计、微量移液器、冰箱、器、冰箱、-80超低温冰箱等主要仪器设备以及必须的超低温冰箱等主要仪器设备以及必须的电脑软件的使用方法、注意事项；电脑软件的使用方法、注意事项；4.2.1 实验材料实验材料 4.2.1.1 主要仪器设备主要仪器设备 高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超净工作台、恒温水浴锅、冰箱。净工作台、恒温水浴锅、冰箱。洁净、经洁净、经121高压灭菌高压灭菌20min 的容量瓶、量的容量瓶、量筒、烧杯、螺口试剂瓶，一次筒、烧杯、螺口试剂瓶，一次 性医用无菌性医用无菌PE 手套、乳胶手套、塑料滴管，一次手套、乳胶手套、塑料滴管，一次性纸杯，记号笔。性纸杯，记号笔。4.2 PTC 尝味能力的测定尝味能力的测定 4.2.1.2 试剂和材料试剂和材料（1）材料：受试者为全体修读遗传学大实验的学生。）材料：受试者为全体修读遗传学大实验的学生。（2）试剂：苯硫脲（）试剂：苯硫脲（PTC）结晶，娃哈哈纯净水。）结晶，娃哈哈纯净水。 4.2.1.3 溶液配制溶液配制（1）原液（）原液（1 号液）：称取号液）：称取PTC 结晶结晶0.65 g，加，加娃哈哈纯净水娃哈哈纯净水500 ml，在室温，在室温(20左右左右)下溶解下溶解l2d（经常摇晃）（或（经常摇晃）（或60水浴中水浴中1 h 充分溶充分溶解），解），PTC 浓度约为浓度约为1750，过滤灭菌。，过滤灭菌。（2）稀释液：用娃哈哈纯净水逐级稀释原液）稀释液：用娃哈哈纯净水逐级稀释原液214 倍，编为倍，编为2-14 号（表号（表4.1）。）。将配好的将配好的14 种浓度种浓度的的PTC 溶液，过滤灭菌，分别置于灭菌过的溶液，过滤灭菌，分别置于灭菌过的100 ml 螺口试剂瓶中。另取娃哈哈纯净水作为第螺口试剂瓶中。另取娃哈哈纯净水作为第15 号液。号液。 4.2.2 实验方法实验方法 （1）让受试者正坐，仰头张嘴伸舌，用滴管滴）让受试者正坐，仰头张嘴伸舌，用滴管滴23 滴滴 15 号液于受试者舌根部，让受试者慢慢咽下反复咂嘴号液于受试者舌根部，让受试者慢慢咽下反复咂嘴品味液体尝味，然后用纯净水做同样的试验，交替给品味液体尝味，然后用纯净水做同样的试验，交替给 受试者尝味，避免受试者的臆意猜测而影响结果的准确。受试者尝味，避免受试者的臆意猜测而影响结果的准确。（2）询问受试者能否鉴别此两种溶液的味道。）询问受试者能否鉴别此两种溶液的味道。（3）若不能鉴别或鉴别不准，则依次用）若不能鉴别或鉴别不准，则依次用 141 号溶液号溶液 重复试验，直到能明确鉴别出重复试验，直到能明确鉴别出PTC 的苦味为止。的苦味为止。（4）复尝味）复尝味3 次，次，3 次结果相同时，才是可靠。次结果相同时，才是可靠。（5）记录所品出苦味的液体的编号和稀释浓度。）记录所品出苦味的液体的编号和稀释浓度。注：统计民族、生源地是想调查注：统计民族、生源地是想调查PTC 味盲分布与民族和地理位置是否有味盲分布与民族和地理位置是否有相关性。（此生源地统计的不是受试者户籍所在地，而是其家族或家相关性。（此生源地统计的不是受试者户籍所在地，而是其家族或家庭成员长期生活的地方）庭成员长期生活的地方）4.3 人口腔上皮细胞总人口腔上皮细胞总 DNA 的提取的提取4.3.1 实验材料实验材料 4.3.1.1 主要仪器设备主要仪器设备 高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超净高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超净工作台、恒温水浴锅、涡旋振荡器、高速离心机、工作台、恒温水浴锅、涡旋振荡器、高速离心机、恒温振荡摇床、微量移液器、电磁炉、冰箱、恒温振荡摇床、微量移液器、电磁炉、冰箱、-80超低温冰箱、计时器、超低温冰箱、计时器、pH 计。计。洁净、经洁净、经 121高压灭菌高压灭菌 20min 的量筒、烧杯、螺口试剂的量筒、烧杯、螺口试剂瓶、牙签、瓶、牙签、1.5 mL灭菌微量离心管、微量移液器灭菌微量离心管、微量移液器吸头（枪头），离心管架，一次性医用无菌吸头（枪头），离心管架，一次性医用无菌 PE 手套、乳胶手套、口罩，记号笔。手套、乳胶手套、口罩，记号笔。4.3 人口腔上皮细胞总人口腔上皮细胞总 DNA 的提取的提取4.3.1.2 试剂和材料试剂和材料（1）材料：每实验小组选取）材料：每实验小组选取 1 名受试者，用灭名受试者，用灭 菌牙签刮取口腔上皮细胞。菌牙签刮取口腔上皮细胞。（2）试剂：灭菌水，）试剂：灭菌水，pH 标准液，细胞基因组标准液，细胞基因组 DNA 提取试剂盒提取试剂盒 4.3 人口腔上皮细胞总人口腔上皮细胞总 DNA 的提取的提取4.3.2 实验方法实验方法（1）在）在 1.5 ml 灭菌微量离心管中加入灭菌微量离心管中加入 100 L 灭菌水。灭菌水。（2）受试者用无菌牙签轻刮口腔腮内侧，刮下来）受试者用无菌牙签轻刮口腔腮内侧，刮下来 的细胞在灭菌水中漂洗。的细胞在灭菌水中漂洗。（3）涡旋振荡器涡旋振荡混匀）涡旋振荡器涡旋振荡混匀 10 s，（4）离心机瞬时离心）离心机瞬时离心 10 s。（5）沸水浴中煮沸）沸水浴中煮沸 5 min。（6）离心机）离心机 13200rpm 离心离心 2 min。（7）基因组）基因组 DNA 4C 保存备保存备 4.5 PTC 基因基因PCR扩增产物的电泳检测扩增产物的电泳检测 4.5.1.4.5.1.主要仪器设备主要仪器设备 高速离心机、小型瞬时离心机、电泳仪、水高速离心机、小型瞬时离心机、电泳仪、水平电泳槽、电子天平、微波炉、凝胶成像仪、平电泳槽、电子天平、微波炉、凝胶成像仪、制冰机、超净工作台、通风橱、微量移液器、制冰机、超净工作台、通风橱、微量移液器、冰箱、冰箱、-80-80超低温冰箱。超低温冰箱。洁净、经洁净、经121121高压灭菌高压灭菌20min 20min 的、微量移的、微量移液器吸头（枪头），离心管架，液器吸头（枪头），离心管架，PCRPCR管架，三管架，三角瓶，一次性医用无菌角瓶，一次性医用无菌 PEPE手套，记号笔，保手套，记号笔，保鲜袋，微波炉用手套，三角瓶，搪瓷盘。鲜袋，微波炉用手套，三角瓶，搪瓷盘。4.5.2.4.5.2.试剂和材料试剂和材料 （1 1）材料：受试者）材料：受试者PTC PTC 基因基因PCR PCR 产物产物 （2 2）试剂：）试剂：Tris Tris 碱，冰乙酸，碱，冰乙酸，NaNa2 2EDTA.2HEDTA.2H2 2 O,O,溴化乙锭，琼脂糖，溴化乙锭，琼脂糖，Marker I Marker I 4.5.3.4.5.3.溶液配制溶液配制 （1 1）5050 TAE TAE 电泳缓冲液（储存液，电泳缓冲液（储存液，pHpH约约8.58.5）：）：Tris Tris 碱碱 242g242g，57.1ml 57.1ml 冰乙酸，冰乙酸，37.2g 37.2g NaNa2 2 EDTA.2HEDTA.2H2 2 O O，去离子水定容至，去离子水定容至1L 1L（2 2）1 1 TAE TAE 电泳缓冲液（工作液）：取电泳缓冲液（工作液）：取5050TAE TAE 电泳缓冲液，去离子水稀释电泳缓冲液，去离子水稀释5050倍倍 (3 3）0.5mg/ml 0.5mg/ml 溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）（）（10001000 储储存液）：存液）：50mg 50mg 溴化乙锭溶于溴化乙锭溶于100mL dd 100mL dd waterwater，4 4C C 避光储存）。避光储存）。(4)(4)溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）工作液：）工作液：0.5mg/ml EB0.5mg/ml EB（10001000 储存液），去离子水稀释储存液），去离子水稀释 10001000倍倍。（注：。（注：EBEB为扁平分子，可以嵌入为扁平分子，可以嵌入DNADNA，为潜，为潜在诱变剂，接触时须带一次性医用无菌在诱变剂，接触时须带一次性医用无菌PEPE手套手套，但也不是洪水猛兽，不小心溅到皮肤上时，但也不是洪水猛兽，不小心溅到皮肤上时，不会被皮肤吸收只是停留在表面，用大量流水不会被皮肤吸收只是停留在表面，用大量流水冲洗即可）。冲洗即可）。（1 1）配制）配制 1.2%1.2%琼脂糖凝胶：称取琼脂糖凝胶：称取 0.6g 0.6g 琼琼脂糖粉，放入三角瓶，加入脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml 1 50ml 1 TAE TAE电电泳缓冲液，放入微波炉中加热，并不断取出泳缓冲液，放入微波炉中加热，并不断取出混匀，注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，直至混匀，注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，直至完全熔解（烫，戴手套）。完全熔解（烫，戴手套）。50ml 50ml 正好倒一正好倒一块大胶（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！块大胶（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。）。（2 2）将胶液置桌面上室温冷却致热但不烫手）将胶液置桌面上室温冷却致热但不烫手（约（约50-6050-60）。）。4.5.2 实验方法实验方法（3）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可。在桌面上静置边缘相平即可。在桌面上静置10-20 分钟待分钟待胶完全凝固胶完全凝固.（剩下的胶溶液封口后留待以（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用），小心拔出梳子，凝胶没入后再熔化使用），小心拔出梳子，凝胶没入电泳槽电泳液中，凝胶上有样品孔的一侧要电泳槽电泳液中，凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。朝向电泳槽的负极。（4）取）取 1 片光面纸，点片光面纸，点 5uL 灭菌水、灭菌水、2uL 6加样缓冲液，再加入加样缓冲液，再加入 5uL PCR 产物制成产物制成10uL DNA 样品。样品。（5）在凝胶上选择相邻的加样孔。用）在凝胶上选择相邻的加样孔。用10ul 的吸液头的吸液头分别依次加入分别依次加入5uL Marker I对照，各小组对照，各小组12uL PCR 产物电泳样品（互相比较）产物电泳样品（互相比较）（6）根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至）根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至120V(10V/cm)，电泳，电泳2030min。（注意正负电极的位置连。（注意正负电极的位置连接正确）。接正确）。（7）把凝胶小心放入盛有）把凝胶小心放入盛有 EB的搪瓷盘中，染色的搪瓷盘中，染色 10分钟分钟后，取出用自来水浸泡后，取出用自来水浸泡10min。（8）放入凝胶成像系统中拍照。）放入凝胶成像系统中拍照。4.6.1 实验材料实验材料4.6.1.1 主要仪器设备主要仪器设备 高压蒸气灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、涡旋振高压蒸气灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、恒温水浴锅、恒温干热议、制冰机、荡器、磁力搅拌器、恒温水浴锅、恒温干热议、制冰机、紫外分光光度计、微量移液器、冰箱、紫外分光光度计、微量移液器、冰箱、-80超低温冰箱。超低温冰箱。洁净、经洁净、经121高压灭菌高压灭菌20min 的的1.5 mL 灭菌微量离心灭菌微量离心管、微量移液器吸头（枪头），离心管架，一次性医用无管、微量移液器吸头（枪头），离心管架，一次性医用无菌菌PE 手套，塑料饭盒，记号笔。手套，塑料饭盒，记号笔。4.6 PTC 基因基因PCR 产物酶切产物酶切4.6.1.2 试剂和材料试剂和材料（1）材料：受试者）材料：受试者PTC 基因基因PCR 产物产物（2）试剂：限制性内切酶）试剂：限制性内切酶Fnu4H4.6.2 实验方法实验方法（1）提前提前2 h 将恒温水浴锅或恒温干热仪将恒温水浴锅或恒温干热仪(或恒温水浴锅或恒温水浴锅)电源打开，调节工作温度稳定至电源打开，调节工作温度稳定至37 C。（2）从制冰机中盛取碎冰（）从制冰机中盛取碎冰（0C），从冰箱中取出所需），从冰箱中取出所需试剂，在碎冰中解冻试剂，在碎冰中解冻（3）将试剂在涡旋振荡器上涡旋振荡混匀）将试剂在涡旋振荡器上涡旋振荡混匀10 s（4）瞬时离心）瞬时离心10 s。（5）取取1L 受试者受试者 PTC 基因纯化基因纯化DNA，用紫外分光光，用紫外分光光度计测定其度计测定其260nm、280nm 下的紫外吸光光度值，进下的紫外吸光光度值，进行行DNA 定量分析。定量分析。（6）在碎冰上按照配方和顺序在）在碎冰上按照配方和顺序在1.5 mL 微量离心管中配制微量离心管中配制酶切缓冲液（为保持酶活性及酶切缓冲液（为保持酶活性及DNA 切割效率，始终在低切割效率，始终在低温下配制）：温下配制）：灭菌超纯水灭菌超纯水 补足补足15L10酶切缓冲液酶切缓冲液 1.5L5 units/L Fnu4H1 1LPTC 基因纯化基因纯化DNA 1g（根据（根据DNA 定量结果加入适当体积溶液）定量结果加入适当体积溶液）总体积总体积 15L（7）37C 恒温酶切过夜恒温酶切过夜（8）酶切产物）酶切产物4C 保存备用保存备用4243444546474849LOGO50