大肠杆菌的保存和培养

大肠杆菌的保存和培养大肠杆菌 培养 保存.一、菌种的保存重组DNA分子（质粒、噬菌体、粘性质粒必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的 重组DNA。通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本 身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此， 而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。由于存在 变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产 质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏 之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。能够长期在研究 上应用。2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的 变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的 积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态， 以减少变异的发生。3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降 低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠 状态，从而可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后 vf fv 的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂 菌。此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚飒（DMSD）等 保护剂。5. 甘油低温保存法（一70C196C）的特点i.甘油菌低温保存的基本原理是：在-70C或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢 处于完全停止状态，故可以长期保存。在0C-70C温度范围内，水晶呈针状，极易招致 细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此，为了避免0。 -70C冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。甘油可降低冰点，在缓 慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70C以下低温中能减少冰 晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌ii.使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1： 1加入60%的甘油和菌液，混 匀后贮存于-70C或液氮中。复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。二、菌种的复苏复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37C培养8-12小时即可。甘 油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0C冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部 分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。切记：接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。三、大肠杆菌培养1. 培养基配制：培养基从形态上分为液体与固体培养基。根据有无抗生素和其他选择性药物分 为普通与选择培养基，常用LB培养基。1) LB(Luria-Bertain)液体培养基配制精解蛋白胨(bacto-tryptone)1.0%酵母浸出粉(bacto-extract)0.5%氯化钠1.0%搅拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培养基)调pH至7.0，如用进口试剂 可不必调，高压灭菌20min(120C 0.1Mpa)2) 含琼脂的固体培养基配制(1) 普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加1.5%琼脂制成，先配液体培养基，然后 加入1.5%琼脂，高压灭菌20min，取出后再无菌状态下铺平板(2) 选择性培养基:将消毒好的固体培养基置室温下冷却50C时加抗生素或其他必加成分， 摇匀后倒入灭菌皿中厚度2-3mm,室温固化。(抗生素用三蒸水溶解后，用无菌滤头过滤到 无菌瓶中，氨苄青霉素终浓度50p l/ml)新制备的固体培养基较湿，铺上的液体不易吸收， 可在室温下放2-3天，或37C放半小时，然后4C保存备用。(3) LB培养基中所用抗生素终浓度：氨苄青霉素-50p l/ml；氯霉素-20p l/ml；庆大霉素-15 p l/ml；卡那霉素-30p l/ml；春日霉素-1000p l/ml；壮观霉素-100p l/ml；链霉素-30p l/ml； 四环素-12p l/mlo注意：除了四环素保存-20C，其余均应保存4C，所有抗生素均应溶于无菌去离子水。四 环素对光敏感2.液体细菌培养1) 小量培养：(1) 取灭菌16或18mm 口径培养管，加3-5mlLB培养基，再加50mg/ml氨苄青霉素 3-5ul (宿主菌不加抗生素)(2) 无菌牙签挑取单菌落，送入培养液中，或取菌液5-10ul，转入培养液中，封好管口37C摇床培养100-200r/min至生长饱和，约6-12小时2) 大量培养:取500ml培养瓶内装培养基100-200ml，及相应抗生素。以0.5-1%浓度接种 菌液，37度摇床培养100-200r/min至OD值0.6-0.8。(即大肠杆菌复苏后按照这个比例来进行扩增，摇床时间大约是.)3.固体细菌培养：用于单一菌落的挑选，转化后抗性菌落的筛选。方法：采用划痕接种法。用接种环从菌种中沾取少量菌液，划线。