手足口病的病原学及实验室检测

手足口病的病原学及实验室检测手足口病的病原学及实验室检测陈立陈立中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家脊灰实验室国家脊灰实验室2010-04-212010-04-21手足口病的病原 引起手足口病的病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，包括：*柯萨奇病毒A组（Coxasckievirus A,CVA）的 2、4、5、7、9、10、16 型等 *B组（Coxasckievirus B,CVB)的1、2、3、4、5 型等；*肠道病毒71型（Human Enterovirus 71,EV71）；*埃可病毒（Echovirus,ECHO）等。其中以EV71及CVA16型较为常见。肠道病毒适合在湿、热的环境下生存与传播，75%酒精和酒精和5%来苏不能将其灭活，对乙醚、去氯胆酸盐等不敏感来苏不能将其灭活，对乙醚、去氯胆酸盐等不敏感；对紫外线和干燥敏感，各种氧化剂(高锰酸钾、漂白粉等)、甲醛、碘酒以及5630分钟可以灭活病毒。病毒在4可存活1年，-20可长期保存，在外环境中可长期存活。流行病学 传染源 患者和隐性感染者患者和隐性感染者。发病前数天，感染者咽部与粪便就可检出病毒，通常以发病后一周内传染性最强。传播途径：可经胃肠道（粪粪-口途径口途径）传播，也可经呼吸道（飞沫、咳嗽、打喷嚏等）传播，亦可因接触患者口鼻分泌物、皮肤或粘膜疱疹液及被污染的手及物品等造成传播 流行：以5岁及以下儿童为主，尤以3岁及以下儿童发病率最高。一般5-7月为发病高峰 实验室诊断临床诊断病例符合下列条件之一者，即可诊断为实验室确诊病例 自咽拭子或咽喉洗液、粪便或肛拭子、脑脊液、疱疹液、血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本中分离到人肠道病毒分离到人肠道病毒（指包括CVA16和EV71等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）。自咽拭子或咽喉洗液、粪便或肛拭子等标本中检检测到测到CVA16 或或EV71特异性核酸，特异性核酸，或从脑脊液、疱疹液、血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本等标本中检测到人肠道病毒（指包括CVA16和EV71等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）的特异性核酸。实验室诊断 血清标本人肠道病毒型特异性中和抗体滴度1 256，或急性期与恢复期血清肠道病毒特异性中和抗体有4倍或4倍以上的升高 病原学监测要求 各省区市卫生行政部门要组织医疗卫生机构开展病原学监测，了解病原动态分布变化。所有重症和死亡病例均需所有重症和死亡病例均需采样。此外，以县（区）为单位，每月最少需采集采样。此外，以县（区）为单位，每月最少需采集5例首例首次就诊的普通病例标本；当月县（区）病例总数少于次就诊的普通病例标本；当月县（区）病例总数少于5例例时，全部采样。时，全部采样。以省（区、市）为单位,在手足口病流行年份中每年至少采集20对EV71 和10对CVA16感染的手足口病患儿的双份血清,以阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。以省（区、市）为单位，每月至少从手足口病病例中分以省（区、市）为单位，每月至少从手足口病病例中分离离10株毒株并做血清型别鉴定，鉴定完成后并将毒株及株毒株并做血清型别鉴定，鉴定完成后并将毒株及鉴定结果于鉴定结果于5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心。个工作日内报送至中国疾病预防控制中心。具备测序条件的省份，可开展具备测序条件的省份，可开展VP1基因序列测定和分析基因序列测定和分析，进行基因定型，序列测定完成后将序列结果于5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心；不具备测序条件者，将毒株送至中国疾病预防控制中心进行序列测定，中国疾病预防控制中心要于28个工作日内反馈基因定型结果。31个省级实验室个省级实验室1国家实验室国家实验室331 个地级实验室个地级实验室l 肠道病毒分离物基因分型肠道病毒分离物基因分型,血清流行病学检测血清流行病学检测,诊诊断方法建立断方法建立l 质量控制质量控制 l 对省级实验室提供技术支持对省级实验室提供技术支持 l肠道病毒分离和鉴定肠道病毒分离和鉴定 (PCR,ICA,PCR-RFLP,real time PCR）l 对地级实验室的质量控制对地级实验室的质量控制l对地级实验室提供技术支持对地级实验室提供技术支持l RT-PCR,Real time PCR 采集标本采集标本 标本采集和检测（1）所有重症和死亡病例均要采集标本所有重症和死亡病例均要采集标本，可以采集咽拭子、粪便或肛拭子、疱疹液、脑脊液、血清等，死亡病例还可采集脑、肺、肠淋巴结等组织标本。聚集性病例至少要采集2例病例标本开展病原学检测。（2）医疗机构负责样本采集医疗机构负责样本采集，疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集。（3）疾病预防控制机构根据本地的技术能力，对采集的标本开展核酸检测、病毒分离；不具备技术条件时，及时送上级机构进行检测。标本的选择标本的选择 粪便标本、肛拭子（3日内,5-8g）咽拭子标本(3日内,维持液)血清标本（发病0-3天，14-30天）疱疹液（多个疱疹作为一个标本）脑脊液标本(出现神经系统症状后3天内）采集标本的种类、保存和运输（一）粪便标本。采集病人发病3日内日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量量5-8g/份份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4暂暂存存12小时内小时内送达实验室，-20以下低温冷以下低温冷冻保藏，冻保藏，需长期保存的标本存于-70冰箱。采集标本的种类、保存和运输（二）咽拭子标本。采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。4暂存并在12小时内送达实验室，-20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70冰箱。采集标本的种类、保存和运输（三）血清标本。各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集EV71 和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。将血清置于-20以下冰箱中冷冻保存。（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多采集多个疱疹作为一份标本个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。所采集标本4暂存立即（12h内）送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。（五）肛拭子标本 采集病人发病3日内的肛拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有35ml保存液（含5%牛血清细胞维持液）的15ml外螺旋的采样管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。（六）尸检标本 采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结2个，分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。（七）脑脊液标本。出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。但EV71感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到EV71病原。标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室。依照人间传染的病原微生物名录，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。在送到省、地、市级CDC实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。在上送标本的同时，需附带相关的手足口病病例临床标本采样登记表。实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）Real-time RT-PCR（rRT-PCR）病毒分离 病毒分离细胞系：RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细 粪便标本和肛拭子的处理：按“手足口病标本采集及检测技术方案”疱疹液标本通常直接用于RNA提取或病毒分离。脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理：按“手足口病标本采集及检测技术方案”咽拭子处理（病毒分离用）咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4条件下，10000 rpm离心20min，用上清接种到细胞上或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。病毒分离结果解释 RD细胞支持HFMD的主要病原体CVA16和EV71等多种肠道病毒的复制，CVA16和和EV71均能在均能在RD细胞培养细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（CPE），），表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。但相同滴度的CVA16和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于的生长速度要快于CVA16，表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CVA16早，EV71接种细胞后出现CPE很快，但CVA16一般要经过2次以上传代才出现明显的CPE。若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致HFMD的病原体，如一些柯萨奇B组病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2细胞中均不繁殖。测定人双份血清标本的中和抗体滴度 比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验 通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证明病毒感染。肠道病毒隐性感染也很常见，所以在评估检测结果时就要小心一些中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清EV71或CVA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1:256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1:128判定为可疑阳性。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的标本处理 粪便标本：采用氯仿进行处理后提取核酸。肛拭子/咽拭子标本：咽拭子要在标本保存液中充分搅动，然后在4条件下，10000 rpm离心20min。疱疹液和脑脊液：直接用于RNA提取逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）RT-PCR实验结果解释表 待检标本RT-PCR结果 鉴定结果 HEV(-),EV71(-),CVA16(-)非肠道病毒（NEV）HEV(+),EV71(-),CVA16(-)非EV71、CVA16的其它肠道病毒 HEV(+),EV71(+),CVA16(-)EV71 HEV(+),EV71(-),CVA16(+)CVA16RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作，可以减少交叉污染的发生 PCR之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作；PCR之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备；将试剂分装保存，尽量减少重复使用的频率；准备和分装试剂应该在无PCR扩增产物的区域内进行；准备寡聚核苷酸引物应该在无PCR扩增产物的环境中进行；只使用能阻止气溶胶产生的吸尖；戴手套（无滑石粉），并经常更换；RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心，避免气溶胶的产生。减少每次处理样品的数量；将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中，最后再加入核酸；加入一个核酸后要盖上盖子，然后再加入其它核酸；使用阳性对照；选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样品作阳性对照；使用一个已知性质的样品作阴性对照；每次实验都要用试剂混合物作为空白对照。它包含除了标本RNA以外的PCR反应所需的所有其它成分。Real-time RT-PCR（rRT-PCR）与普通PCR模式相比,实时荧光PCR具备几个方面的优势优势:封闭反应，污染机会少。无需PCR后处理（杂交，电泳，拍照）。操作简单，高度自动化。特异性强，灵敏度高。用途广泛，既能定量又能定性。采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确。仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断。可实现一管双检或多检。操作安全，缩短时间，提高效率。荧光定量PCR是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5ul模板量），不够部分以水补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。从试剂盒中取出相应的试剂，反应液在室温融化后，瞬时离心，按n+1配置反应体系（n=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照）每次实验均应设立阳性对照和阴性对照每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照：核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本。阳性对照：提取好的阳性核酸作为模板RNArRT-PCR结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准，或可根据仪器噪音情况进行调整。Ct值的样本为阳性。Ct值无数值的标本和Ct值的样本为阴性样本。38.0 Ct值的样本为临界值。注：荧光PCR同时读取FAM和HEX，进行双通道检测，FAM荧光Ct值为CVA16的结果，HEX荧光 Ct值为EV71的结果。生物安全 柯萨奇病毒、埃可病毒、EV71型和目前分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物。在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全II级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。生物安全 操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全，要在II级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒鉴定，无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫。灭活后的血清抗体检测与PCR检测可在生物安全I级实验室进行。所有操作应遵守国家相关法律法规。