冰冻切片步骤很全面

冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水 为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何 化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经 过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学 的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。1. 取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。2. 速冻：为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需 要，一般 在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间， 减少冰晶的形成。液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块 平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直径约2cm)，如组织块小可适量加OCT包 埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接 触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s 组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若 需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80C冰箱贮存备用。3. 固定：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4C冰箱预冷 5-10min让OCT胶浸透组织。取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架(PE) 上 30min。4. 切片:恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低 温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10MnL 切片时，低温室内温度以-15C-20C为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板 的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。切好室温放置 30min后，入4。丙酮固定510min，烘箱干燥20min。PBS洗5minX3。进 行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育510min， 消除内源性过氧化物酶的活性。5. 免疫荧光染色：冰冻切片室温晾干15min,可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切 片1小时（此步可不洗）滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原 则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸），将切片放 在加了 PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4C过夜。第二天先将湿盒放到37C回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将 切片插入到小染缸PBS冲洗。滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37C孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5minX3次。滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）。回收DAPI，滴加5-10U1抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的 盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。做好的片放 在切片盒内，置于4C冰箱，可保存一周左右。