酶促反应动力学多底物动力学

第二节第二节 多底物反应及其动力学多底物反应及其动力学一一 反应机制的分类：反应机制的分类：(一一)Cleland表示法的基本符号和概念：表示法的基本符号和概念：v底物：依照底物与酶结合的顺序依次用底物：依照底物与酶结合的顺序依次用 A、B、C、D表示表示v产物：根据产物从酶上脱落的顺序用产物：根据产物从酶上脱落的顺序用 P、Q、R、S 表示表示v游离酶：游离酶：E、F、Gv抑制常数：抑制常数：KiA、KiB;KiP、KiQ v米氏常数：米氏常数：KmA、KmB;KmP、KmQ v抑制剂：抑制剂：I v修饰剂：修饰剂：X或或Yv反应分子数反应分子数:Uni(单单)、Bi(双双)、Ter(三三)、Quad(四四)v酶反应中间物：分为两类酶反应中间物：分为两类 (1)稳态中间物稳态中间物：指酶和底物以共价键结合形成的较为稳定的中间物。可指酶和底物以共价键结合形成的较为稳定的中间物。可以发生双分子反应而不能自身解离。例如：某些以发生双分子反应而不能自身解离。例如：某些Ser蛋白酶蛋白酶在催化过程中形成的酰化酶中间物在催化过程中形成的酰化酶中间物 包括：共价结合的包括：共价结合的ES中间物；自由酶中间物；自由酶 (2)过渡态复合物过渡态复合物：非稳定的酶中间物，本身可以单分子解离或异构化之后非稳定的酶中间物，本身可以单分子解离或异构化之后再解离出产物或底物。再解离出产物或底物。分为分为:非中心复合物：酶未完全被底物饱和非中心复合物：酶未完全被底物饱和 中心复合物：中心复合物：酶已经完全被底物饱和，酶已经完全被底物饱和，(EAB EPQ);(EA EP)(二二)反应机制的分类和命名反应机制的分类和命名 (以双底物双产物反应为例）：以双底物双产物反应为例）：1.序列序列(sequential)反应机制反应机制:酶必需与所有底物都结合之后才有产物放出。对于双酶必需与所有底物都结合之后才有产物放出。对于双底物双产物反应，必有酶底物双产物反应，必有酶-底物三元复合物形成。底物三元复合物形成。v 根据底物及产物与酶的结合及释放是否有序分为根据底物及产物与酶的结合及释放是否有序分为:(1)有序双双双底物双产物反应有序双双双底物双产物反应(ordered Bi Bi)：A B P Q E EA (EABEPQ)EQ E v EA、EQ:非中心复合物；非中心复合物；(EAB EPQ):中心复合物中心复合物v A：领先底物；：领先底物；B：随后底物：随后底物 例如：许多以例如：许多以NAD+或或NADP+为辅酶的脱氢酶类，为辅酶的脱氢酶类，乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDH)、苹果酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶(MDH)等等 NAD+苹果酸苹果酸(MA)草酰乙酸草酰乙酸(OAA)NADH MA OAA E ENAD+(ENAD+E NADH)E NADH E v NAD+/NADH 形成形成外底物对外底物对v机制：由于底物机制：由于底物A与酶结合后改变了酶的构象，使与酶结合后改变了酶的构象，使 原来隐蔽的原来隐蔽的B结合位点暴露，结合位点暴露，B才能结合上去。才能结合上去。暗示：暗示：A与与B可能结合在酶的不同部位。可能结合在酶的不同部位。(2)Theorell-Chance(T-C 机制机制)：A B P Q E EA EQ E 第二个底物第二个底物B结合及释放非常快，没有明显的三元复合结合及释放非常快，没有明显的三元复合物变构过程。可看作是三元复合物浓度极低的序列有序机制。物变构过程。可看作是三元复合物浓度极低的序列有序机制。例如：马肝醇脱氢酶：例如：马肝醇脱氢酶：NAD+乙醇乙醇 乙醛乙醛 NADH E ENAD+E NADH E(3)随机双双随机双双(random Bi Bi)：A B P Q EA EQ E （EABEPQ）E B A Q Pv 产物从酶上的释放及底物和酶的结合无一定顺序。产物从酶上的释放及底物和酶的结合无一定顺序。v少数脱氢酶和一些磷酸激酶属于该类，例如肌酸激少数脱氢酶和一些磷酸激酶属于该类，例如肌酸激酶酶:肌酸肌酸+ATP 磷酸肌酸磷酸肌酸+ADPv机制：酶蛋白上的机制：酶蛋白上的A、B结合位均处于暴露状态，结合位均处于暴露状态，两者与底物的结合即互不干扰，也不互相依赖。两者与底物的结合即互不干扰，也不互相依赖。EBEP2 乒乓机制乒乓机制(Ping-Pang Bi Bi)：各种底物全部和酶结合以前各种底物全部和酶结合以前，已经有一种或多种，已经有一种或多种底物放出，不形成三元复合物。底物放出，不形成三元复合物。A P B Q E (EAFP)F (FBEQ)Ev属于该机制的酶大多数具有辅酶，如转氨酶、黄素属于该机制的酶大多数具有辅酶，如转氨酶、黄素酶等。谷草转氨酶属于典型的乒乓机制：酶等。谷草转氨酶属于典型的乒乓机制：Asp OAA AKG Glu ECHO (ECHOAsp ENH2 (ENH2AKG ECHO ENH2OAA)ECHOGlu)v总结：总结：有序机制有序机制 序列反应机制序列反应机制 T-C 机制机制 随机机制随机机制 乒乓反应机制乒乓反应机制二二 King-Altman法法速度方程图示法速度方程图示法(一一)Kappa表示法表示法:E +A k1 EA 1 k-1 2 Vf=k1 A E;Vr=k-1 EAv Kappa()=速度常数项速度常数项 底物底物(产物产物)浓度项浓度项 正向反应的正向反应的Kappa：12=k1 A 逆向反应的逆向反应的Kappa：21=k-1 反应速度：反应速度：Vf=12 E;Vr=21 EA v 具有方向性，是一个矢量。其方向与酶形式的具有方向性，是一个矢量。其方向与酶形式的 流向有关流向有关(二二)King-Altman 法步骤法步骤:(1)首先写出反应历程，然后将反应历程安排成封首先写出反应历程，然后将反应历程安排成封闭环形式。环的角数就是酶存在形式数目，用闭环形式。环的角数就是酶存在形式数目，用n表表示。然后在各角之间连线上标出各步反应的示。然后在各角之间连线上标出各步反应的。E+A k1 EA k2 EP k3 E+P k-1 k-2 k-3 E k1A EA k-1 k-3P k3 k2 k-2 EP E =k-1k3 +k-1k-2+k2k3 EA=k1k3 A +k1k-2A+k-2k-3P EP=k-1k-3P+k1k2A+k2k-3P E k1A EA k-3P k3 k-1 k2 k-2 EP E:EA:EP:（2）画出画出King-Altman 图形，即：所有流向各种酶形式的图形，即：所有流向各种酶形式的n1 线矢量图，再将各步反应的线矢量图，再将各步反应的标到矢量图上标到矢量图上,并并写出流向写出流向 各种酶形式的各种酶形式的乘积之和。乘积之和。k-1 k3k-2k-1k3 k2k1Ak3k1Ak-2k-3Pk-2k-3Pk-1k1Ak2k-3Pk2（3）速度方程推导）速度方程推导:v 各种酶形式的浓度与其各种酶形式的浓度与其乘积之和成正比乘积之和成正比:E E ;EA EA;EP EP E0 =E +EA+EP E =E E0 E=（E）E0 EA =EA E0 EA=（EA）E0 EP =EP E0 EP=（EP）E0 V=k3 EPk-3 E P=(k3EP/k-3 PE/)E0 =(k1k2k3 A k-1k-2 k-3 P)E0 (k-1k3+k-1k-2+k2k3)+k1(k2+k-2+k3)A+k-3(k-1+k-2+k2)P =num1A num2P const+coefA A+coefP P num1:分子中分子中A项之前的系数乘以项之前的系数乘以E0 num2:分子中分子中P项之前的系数乘以项之前的系数乘以E0 const:分母常数项分母常数项 coefA:分母中分母中A项之前的系数项之前的系数 coefP:分母中分母中P项之前的系数项之前的系数 E k1A EA k-3P k3 k-1 k2 k-2 EP (三三)注意注意:矢量图数目的计算矢量图数目的计算:n-1线矢量图数目线矢量图数目=m!(n-1)!(m-n+1)!n=角数角数;m=封闭环的线数封闭环的线数 n=3;m=3;n-1线矢量图数目线矢量图数目=3!=3 (3-1)!(3-3+1)!King-Altman 图形不包含封闭环形式：图形不包含封闭环形式：E1 E2 E3 E4 v n=4，m=5 n-1线（线（3线）图数目线）图数目=5！=10个，个，(4-1)！(5-4+1)！v 2个封闭环形式无效，应去除。共有个封闭环形式无效，应去除。共有8个有效的个有效的 King-Altman 图形图形 反应历程中有时可能没有逆反应，此时有些反应历程中有时可能没有逆反应，此时有些 King-Altman 图形不存在。图形不存在。E+A k1 EA k2 EP k3 E+P k-1 k-2 此反应若没有此反应若没有k-3 线，则某些线，则某些King-Altman 图形不图形不存在，反应速度中凡是含存在，反应速度中凡是含k-3 项项 者不存在。者不存在。K-3 E:k-1 k-1 k3 k3 k-2 k2 EA:k1A k1A k3 k-2 k-3P k-2 EP:k-1 k1A k-3P k2 k-3P k2 E =k-1k3 +k-1k-2+k2k3 EA=k1k3 A +k1k-2A+k-2k-3P EP=k-1k-3P+k1k2A+k2k-3P E k1A EA k-3P k3 k-1 k2 k-2 EP V=k3 EPk-3 E P =(k1k2k3 A k-1k-2 k-3 P)E0 (k-1k3+k-1k-2+k2k3)+k1(k2+k-2+k3)A+k-3(k-1+k-2+k2)P =num1A num2P const+coefA A+coefP P 三三 双底物反应动力学双底物反应动力学(一一)有序双双机制：有序双双机制：1 方程的推导：方程的推导：E+A k1 EA+B k2 (EABEPQ)k3 EQ+P k-1 k-2 k-3 k-4 k4 E+Q E k1A EA k-1 k4 k-4Q k-2 k2B k-3P EQ (EABEPQ)k3v n=4,m=4,则则n-1线线(3线线)矢量图数目为矢量图数目为4 E:EA:EAB:EQ:k4 k1Ak-3Pk-1k1Ak-4Qk-4Qk-3Pk-3Pk2Bk2Bk2Bk-3Pk-1k-1k-1 k4 k4 k4 k3k3k2Bk-2k-2k-1k-1k1Ak-4Qk-4Qk-4Qk3k3k3k2Bk2Bk-2k1Ak1Ak1A k4 k4 k-4Qk-3Pk-3Pk3k-2k-2k-2V=k4EQ k-4EQ =(k4EQ k-4QE)E0 =num1AB-num2PQ const+coefA A+coefBB+coefPP+coefQQ +coefABAB+coefAPAP+coefBQBQ+coefPQPQ +coefABPABP+coefBPQBPQv若不考虑产物的影响，即若不考虑产物的影响，即 P=0,Q=0 初速度初速度V=num1AB const+coefAA+coefBB+coefABAB2 动力学常数的定义：动力学常数的定义：v 最大反应速度：最大反应速度：正向：正向：Vmf=num1 逆向：逆向：Vmr=num2 coefAB coefABv 米氏常数：米氏常数：KmA=coefB KmB=coefA coefAB coefAB KmP=coefQ KmQ=coefP coefPQ coefPQv 解离常数：解离常数：KiA=const KiB=const coefA coefB KiP=const KiQ=const coefP coefQV=num1AB const+coefAA+coefBB+coefABAB =num1ABcoefAB const coefA+coefA A +coefB B +coefAB AB coefA coefAB coefAB coefAB coefAB V=VmfAB KiA KmB+KmBA+KmAB+AB v 双底物反应中米氏常数的意义：双底物反应中米氏常数的意义：KmA：是是B饱和时酶对底物饱和时酶对底物A的米氏常数的米氏常数 KmB：是是A饱和时酶对底物饱和时酶对底物B的米氏常数的米氏常数3 有序机制动力学常数的求取有序机制动力学常数的求取(二次作图法二次作图法)：v第一次为双倒数作图，一般固定其中一个底物的浓度，变化第一次为双倒数作图，一般固定其中一个底物的浓度，变化另一个（例如：固定另一个（例如：固定B，变化，变化A）。将有序机制的动力学）。将有序机制的动力学方程进行双倒数处理：方程进行双倒数处理：1 =KmA(1+KmBKiA)1 +1 (1+KmB)V Vm KmAB A Vm Bv若将若将B固定于不同的浓度，则以固定于不同的浓度，则以 1/V 1/A 作图可得一组相交于第二作图可得一组相交于第二 或第三象限的直线，其交点座标为：或第三象限的直线，其交点座标为：-1 1 (1-KmA)KiA,Vm KiA1/V1/AB1B2B3 纵截距为：纵截距为：1 (1+KmB)Vm Bv第二次作图：纵截距第二次作图：纵截距1/B作图作图v由第二次的作图可知由第二次的作图可知 KmB和和Vm,代入交点坐标中可知代入交点坐标中可知KmAv若若A(A饱和时饱和时)：1 =1 (1+KmB )V Vm B 转化为米氏方程转化为米氏方程v若若B(B饱和时饱和时):1 =1 (1+KmA )V Vm Av这就是水解反应可看作是单底物反应的原因，因为另一底物这就是水解反应可看作是单底物反应的原因，因为另一底物是水，其浓度可看作是饱和。是水，其浓度可看作是饱和。纵截距纵截距：1 (1+KmB)Vm B1/B1/Vm-1 KmB(二二)随机双双：随机双双：1 动力学方程推导：动力学方程推导：m=8,n=6,n-1=5线图：线图：56个个 封闭环：封闭环：24个个 有效图形：有效图形：32个个 EAEBEPEQE(EABEPQ)v假设反应过程第一个底物与酶结合或第一个产物从酶假设反应过程第一个底物与酶结合或第一个产物从酶释放是迅速平衡过程释放是迅速平衡过程迅速平衡随机双双迅速平衡随机双双:V=num1AB-num2PQ const+coefA A+coefBB+coefPP+coefQQ +coefABAB+coefPQPQv 若若P=0 Q=0 则则 :V=num1AB const+coefA A+coefBB+coefABAB V=VmfAB KiA KmB+KmBA+KmAB+ABv 此方程与有序机制相同，称为序列机制的总方程。此方程与有序机制相同，称为序列机制的总方程。(三三)乒乓双双机制：乒乓双双机制：1 速度方程速度方程:乒乓机制的乒乓机制的King-Altman环形表达式为：环形表达式为：E k1A (EAFP)k-1 k4 k-4Q k2 k-2P (EQFB)k-3 F k3B vm=4 n=4，每种酶都有，每种酶都有4种种3线图。线图。V=num1AB-num2PQ coefA A+coefBB+coefPP+coefQQ+coefABAB+coefAPAP+coefBQBQ+coefPQPQ v若不计产物影响，若不计产物影响，P=0 Q=0，则：，则：V=num1AB coefA A+coefBB+coefABAB V=VmfAB KmAB+KmBA+AB2.乒乓机制动力学常数的求取：乒乓机制动力学常数的求取：(1)双倒数图：若固定双倒数图：若固定B变化变化A 1 =1 (1+KmB+KmA )V Vm B A 横截距：横截距：纵截距：纵截距：(2)纵截距纵截距 1/B作图：作图：从二次作图的横纵截距中求取从二次作图的横纵截距中求取 Vm和和KmB，带入双倒数图的，带入双倒数图的 横截距表达式求取横截距表达式求取KmA。1/V1/A1 (1+KmB)Vm B-1 (1+KmB)KmA BB1B2B31 (1+KmB)Vm B-1 (1+KmB)KmA B1/B1/Vm-1 KmB纵截距纵截距v 若固定若固定A 变化变化B，也可得到一组平行线，以二，也可得到一组平行线，以二次作图法同样求取各动力学常数。次作图法同样求取各动力学常数。v 若若A，1 =1 (1+KmB )V Vm B 若若B 1 =1 (1+KmA )V Vm Av即：当其中一种底物饱和时，另一种底物与酶的即：当其中一种底物饱和时，另一种底物与酶的反应符合米氏方程，可看作单底物动力学反应符合米氏方程，可看作单底物动力学 小结小结机制机制动力学方程动力学方程(不考虑产物不考虑产物)动力动力学学常数常数双倒数双倒数图特征图特征序列机制序列机制(有序双双、有序双双、迅速平衡迅速平衡 随机双双）随机双双）V=VmfAB KmBKiA+KmAB+KmBA+AB4个个相交于相交于一点一点乒乓机制乒乓机制 V=VmfAB KmAB+KmBA+AB3个个 一组一组平行线平行线