第七章免疫技术

第一节第一节 基本技术基本技术(一)、分离纯化抗原或抗体的一般理化技术 、沉淀法常用有机溶剂沉淀法、盐析法，用于蛋白粗提。2、过滤法 也称分子筛，一般用凝胶层析，为不完全筛。常用有葡聚糖、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。3、离子交换色谱法常用有离子交换纤维素、离子交换葡聚糖等。4、亲合色谱法 常用有抗原或抗体交联葡聚糖、琼脂糖凝胶、戊二醛等。5、电泳法1)区带电泳(Zone electrophoresis)2)免疫电泳6、离心法(二)、制备单克隆抗体的方法 在免疫学实验中常需要取得纯化的特异性抗体。单克隆抗体是利用细胞杂交技术形成可分泌某种特异性抗体的肿瘤细胞，进行持续传代而获得的特异性抗体。经典模式为通过抗原免疫动物(通常为小鼠)获得有关B细胞，使其与同系骨髓瘤细胞融合，选择出能产生针对该抗原的特异性抗体的稳定杂种瘤细胞，既有可持续传代的肿瘤细胞特性又有可分泌特异性抗体的特性 第二节第二节 体外抗原抗体反应及其应用体外抗原抗体反应及其应用1、体外抗原抗体反应2、经典的血清学反应3、免疫标记技术 抗原抗体反应抗原抗体反应1、抗原抗体的结合与析出2、抗原抗体反应的特点3、抗原抗体反应的影响因素引起抗原抗体结合的作用力引起抗原抗体结合的作用力1、电荷引力（库仑引力）2、电子云引力（Van der Waals力）3、氢键结合力4、疏水作用力抗原抗体结合物析出的原因抗原抗体结合物析出的原因析出+电解质+抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点1、特异性2、适合比例性3、可逆性特异性特异性抗原A抗原C抗原B特异性反应交叉反应无反应适合比例性适合比例性抗体含量抗原含量前带后带等价带网格学说网格学说（lattice theory）抗体过剩抗原过剩抗体抗体比例合适可逆性可逆性K（亲和常数）=Ag+AbAg Ab 抗原抗体反应的影响因素抗原抗体反应的影响因素1、电解质2、酸碱度（pH值6-8）3、温度（37-42。C）经典血清学反应的种类经典血清学反应的种类类型 抗原 抗体 辅助物 敏感度（g抗体氮）凝集反应 颗粒性 凝集素 0.01沉淀反应 可溶性 沉淀素 5-10溶血（菌）红细胞 溶血素 补体 0.001-0.3反应 G-细菌 溶菌素 补体 （同上）补体结合 固定补 补体反应 体抗体 SRBC 溶血素 0.1中和反应 外毒素 抗毒素 靶细胞 0.01 病毒 中和抗体 靶细胞 （同上）直接凝集反应直接凝集反应颗粒性抗原凝集素正向间接凝集反应正向间接凝集反应可溶性抗原载体颗粒反向间接凝集反应反向间接凝集反应抗体可溶性抗原载体颗粒间接凝集抑制反应间接凝集抑制反应凝集凝集抑制待检样品待检样品Coombs试验试验抗人免疫球蛋白液相内沉淀反应液相内沉淀反应絮状沉淀反应环状沉淀反应+抗血清抗原抗原抗体免疫比浊凝胶内沉淀反应凝胶内沉淀反应免疫扩散技术免疫电泳技术单向扩散试验双向扩散试验火箭电泳对流电泳免疫电泳主要的免疫标记物主要的免疫标记物类别 标记物 用途荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定 标记免疫技术的分类标记免疫技术的分类一、按测定用途分类：1、免疫组化技术2、免疫测定技术二、按标记物分类：1、酶免疫技术2、荧光免疫技术3、放射免疫技术4、发光免疫技术5、金免疫技术直接法间接法补体法双标记法结合相游离相1 2 5 10 20 50 10040302010未标记抗原含量未标记抗原含量结结合、合、游游离离相相放放射射性性含含量量比比值值ELISA间接法间接法夹心法夹心法竞争法竞争法 第三节第三节 免疫细胞检测技术免疫细胞检测技术1、细胞表面标志检测2、细胞功能检测3、细胞因子检测常用的免疫细胞表面标志检测技术常用的免疫细胞表面标志检测技术一、免疫标记检测1、荧光抗体法2、酶免疫检测法3、免疫金银染色法二、补体依赖的细胞毒试验（CDC）三、花环形成试验1、E花环2、EA花环3、EAC花环SmIg的荧光抗体检测法的荧光抗体检测法SmIg的酶免疫检测法的酶免疫检测法补体依赖的细胞毒试验补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体E-花环花环T细胞B细胞花环形成细胞绵羊红细胞EA-花环花环EAC-花环花环一、转化、增殖试验1、淋巴细胞转化试验2、混合淋巴细胞培养二、细胞毒检测1、T细胞介导的细胞毒试验2、NK活性测定3、ADCC作用测定常用的免疫细胞功能检测技术常用的免疫细胞功能检测技术放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋淋巴巴细细胞胞转转化化试试验验原原理理示示意意放射性测定细细胞胞毒毒试试验验原原理理示示意意靶细胞效应细胞分离上清可检测的细胞因子可检测的细胞因子白细胞介素（Interleukin）IL-1、IL-2、IL-18干扰素（Interferon）IFN-、IFN-、IFN-肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）TNF-、TNF-集落刺激因子（Colony-stimulating factor）M-CSF、G-CSF转化生长因子（Transforming growth factor）TGF-趋化因子（Chemokine）IL-8、GROs、MCP-1生长因子（Growth factor）EGF、FGF、IGF、PDGF细胞因子检测的特点细胞因子检测的特点1、免疫原性较弱2、样品含量低3、样品具有时效性4、生物效应特异性差细胞因子检测的方法细胞因子检测的方法1、免疫标记技术检测抗原性测定2、细胞生物学方法检测生物活性测定3、分子生物学技术检测mRNA表达测定细胞因子生物学方法检测的类型细胞因子生物学方法检测的类型一、细胞增殖试验二、细胞病变保护试验三、细胞毒试验四、趋化试验待检样品（细胞上清）指示细胞（CTLL-2）按不同稀释度加入37C，16-20小时加入3HTdR（1-5Ci）37C，4-6小时收集细胞测定白细胞介素白细胞介素-2-2的测定示意图的测定示意图待检样品（细胞上清）指示细胞（L929）按不同稀释度加入37C，4小时37C，24-48小时弃取上清，加入VSV观察细胞病变（镜检或比色）干扰素的测定示意图干扰素的测定示意图肿瘤坏死因子的测定示意图肿瘤坏死因子的测定示意图待检样品（细胞上清）指示细胞（L929）按不同稀释度加入37C，24小时弃取上清，洗涤加入结晶紫染液，洗涤加入细胞裂解液，比色