419核苷酸与核酸

重点内容重点内容核苷酸与核酸核苷酸与核酸 Nucleotides and Nucleotides and Nucleic AcidsNucleic Acids核酸通论核酸通论脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（核糖核酸（RNA）核酸（核酸（nucleic acid）核核 酸（酸（nucleic acid）核苷酸（核苷酸（nucleotide）磷酸（磷酸（phosphoric acid）核苷（核苷（nucleoside）戊糖（戊糖（pentose）碱基（碱基（base）一、核酸的组成一、核酸的组成核酸的结构核酸的结构或核糖或核糖核酸的结构核酸的结构 核糖与碱基之间通过核糖与碱基之间通过N-(-)糖苷键相连，形成糖苷键相连，形成核苷；核苷；核苷中的戊糖羟基被磷酸酯化，形成核苷酸，核苷中的戊糖羟基被磷酸酯化，形成核苷酸，核苷与磷酸之间主要通过核苷与磷酸之间主要通过5-磷酸酯键相连。磷酸酯键相连。核酸的结构核酸的结构嘧啶核苷嘧啶核苷嘌呤核苷嘌呤核苷(OH)(OH)二、核酸的共价结构二、核酸的共价结构 核酸（核酸（DNA与与RNA）是核苷酸聚合成的生物大分子，）是核苷酸聚合成的生物大分子，无分支结构。无分支结构。核酸的共价结构就是核酸的一级结构，通常指核酸核酸的共价结构就是核酸的一级结构，通常指核酸的核苷酸序列。的核苷酸序列。核酸的结构核酸的结构 DNA与与RNA均以均以3,5-3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键连接核苷酸。连接核苷酸。核酸的结构核酸的结构三、三、DNA的三维空间结构的三维空间结构 二级结构：二级结构：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋（的双螺旋（double helix）结构。）结构。三级结构：三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。双链进一步折叠卷曲形成的构象。四级结构：四级结构：DNA与蛋白质的复合体结构与蛋白质的复合体结构核酸的结构核酸的结构（一）（一）DNA的二级结构的二级结构核酸的结构核酸的结构1953年，年，Watson和和Crick根据根据Chargaff 规律和规律和DNA钠盐纤维的钠盐纤维的X光衍射光衍射结果提出了结果提出了DNA的双螺的双螺旋结构模型。旋结构模型。Watson-Crick双螺旋结构模型双螺旋结构模型核酸的结构核酸的结构 两条反向平行（一条两条反向平行（一条53，另一条，另一条35）的多核）的多核苷酸链绕同一中心轴相互缠绕，形成右手双股螺旋。苷酸链绕同一中心轴相互缠绕，形成右手双股螺旋。核酸的结构核酸的结构 碱基位于双螺旋的内碱基位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖侧，磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，构成在双螺旋外侧，构成DNA分子的骨架；外分子的骨架；外部亲水，内部疏水。部亲水，内部疏水。核酸的结构核酸的结构 碱基平面接近与纵轴垂直，糖环的平面接近与纵轴碱基平面接近与纵轴垂直，糖环的平面接近与纵轴平行。平行。核酸的结构核酸的结构 双螺旋是一种双螺旋是一种有规律的结构有规律的结构平均直径平均直径2 nm螺距螺距3.4 nm每旋转一周的核每旋转一周的核苷酸数目苷酸数目10碱基堆积距离碱基堆积距离0.34 nm相邻核苷酸夹角相邻核苷酸夹角36o2.0 nm核酸的结构核酸的结构 大沟与小沟。大沟与小沟。核酸的结构核酸的结构 两条链依靠碱基之间形成的氢键结合在一起。两条链依靠碱基之间形成的氢键结合在一起。碱基配对碱基配对原则：原则：AT GC稳定双螺旋结构的因素稳定双螺旋结构的因素碱基堆积力碱基堆积力（base-stacking interactions）疏水作用范德华力疏水作用范德华力碱基配对的氢键。碱基配对的氢键。GC含量越多，双螺旋越稳定。含量越多，双螺旋越稳定。核酸的结构核酸的结构核酸的结构核酸的结构l 碱基在一条链上的排碱基在一条链上的排列顺序不受任何影响；列顺序不受任何影响；但是根据碱基配对原则，但是根据碱基配对原则，当一条链的序列被确定当一条链的序列被确定后，即可决定另一条互后，即可决定另一条互补链的序列。补链的序列。(二）二）DNA的三级结构的三级结构 DNA在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的构象在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的构象 包括不同二级结构单元间的相互作用、单链与二级结构单包括不同二级结构单元间的相互作用、单链与二级结构单元间的相互作用以及元间的相互作用以及DNA的拓扑特征的拓扑特征 超螺旋（超螺旋（supercoil）是）是DNA三级结构的主要形式三级结构的主要形式核酸的结构核酸的结构核酸的结构核酸的结构超螺旋的功能超螺旋的功能超螺旋有助于超螺旋有助于DNA在细胞内的包装；在细胞内的包装；负超螺旋易于解链，有利于负超螺旋易于解链，有利于DNA的复制、重组和转录的复制、重组和转录等过程的进行；等过程的进行；生物体内可通过调节生物体内可通过调节DNA的拓扑结构来调节其功能。的拓扑结构来调节其功能。（三）（三）DNA与蛋白质复合物的结构（四级结构）与蛋白质复合物的结构（四级结构）核酸的结构核酸的结构病毒：病毒：类型多样（环状双链、线型双链、线型单链、环状单链）类型多样（环状双链、线型双链、线型单链、环状单链）原核：原核：环状双链分子，集中于核区，包括染色体环状双链分子，集中于核区，包括染色体DNA与质粒与质粒DNA真核真核：细胞核细胞核DNA线型双链分子，与组蛋白等形成线型双链分子，与组蛋白等形成染色体染色体（chromosome）细胞器细胞器DNA环状双链分子，一般裸露环状双链分子，一般裸露 染色体染色体DNA组装不同层次的结构组装不同层次的结构核酸的结构核酸的结构核酸的结构核酸的结构四、四、RNA的结构的结构l RNA通常是单链线型分子通常是单链线型分子l RNA可自身回折形成局部双螺旋（二级结构），并进一可自身回折形成局部双螺旋（二级结构），并进一步折叠形成三级结构步折叠形成三级结构l RNA可与蛋白质形成核蛋白复合体（四级结构，例如核可与蛋白质形成核蛋白复合体（四级结构，例如核糖体）糖体）tRNA的高级结构的高级结构 三叶草形二级结构：茎环三叶草形二级结构：茎环 倒倒L形三级结构形三级结构 核酸的结构核酸的结构核酸的结构核酸的结构l 维系维系tRNA三级结构的因素：氢键、碱基堆积力三级结构的因素：氢键、碱基堆积力l tRNA分子功能：转运氨基酸分子功能：转运氨基酸l tRNA分子具有与其功能相适应的柔韧性。分子具有与其功能相适应的柔韧性。核酸的水解核酸的水解 核酸的酸碱性质核酸的酸碱性质 核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收 核酸的变性和复性核酸的变性和复性核酸的理化性质核酸的理化性质一、核酸的水解一、核酸的水解 对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键，脱氧核糖核糖对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键，脱氧核糖核糖 RNA的磷酸酯键对碱敏感，的磷酸酯键对碱敏感，DNA抗碱水解（生理意义）抗碱水解（生理意义）酶水解：酶的专一性；限制性内切酶（特点、应用）酶水解：酶的专一性；限制性内切酶（特点、应用）核酸的理化性质核酸的理化性质二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质 碱基、核苷与核苷酸均能发生解离碱基、核苷与核苷酸均能发生解离 核苷酸与核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因核苷酸与核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此核苷酸与核酸具有两性解离的性质。此核苷酸与核酸具有两性解离的性质。核苷酸与核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等核苷酸与核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏低（等电点的应用）电点偏低（等电点的应用）核酸的理化性质核酸的理化性质三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收核酸的理化性质核酸的理化性质l 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在酸和核酸在240290nm的紫外波段有强烈的光吸收的紫外波段有强烈的光吸收l max260nm 紫外吸收光谱的应用紫外吸收光谱的应用鉴定纯度鉴定纯度核苷酸与核酸含量计算核苷酸与核酸含量计算判断变性（判断变性（增色效应、减色效应增色效应、减色效应）核酸的理化性质核酸的理化性质在在DNA的变性过程中，的变性过程中，(P)值值增大（增色效应，增大（增色效应，hyperchromic effect）在在DNA的复性过程中，的复性过程中，(P)值值减小（减色效应，减小（减色效应，hypochromic effect）四、核酸的变性、复性及杂交四、核酸的变性、复性及杂交核酸的理化性质核酸的理化性质(一一)变性（变性（denaturation）核酸双螺旋区的核酸双螺旋区的氢键氢键断裂，变成单链，不涉及断裂，变成单链，不涉及共价键共价键断裂。断裂。熔解温度（熔解温度（Tm）：）：加热变性使加热变性使DNA的双螺旋的双螺旋结构失去一半时的温度。结构失去一半时的温度。核酸的理化性质核酸的理化性质melting temperature 影响影响DNA的的Tm值的因素值的因素(二二)复性复性核酸的理化性质核酸的理化性质 变性变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。影响影响DNA复性的因素复性的因素 降温速率，负效应（热变性的降温速率，负效应（热变性的DNA在缓慢冷却的条件在缓慢冷却的条件下可以复性，称为退火下可以复性，称为退火annealing）(三三)分子杂交（分子杂交（hybridization）核酸的理化性质核酸的理化性质 在变性的在变性的DNA溶液中加入外源溶液中加入外源DNA单链分子或单链分子或RNA单链分子（与原单链分子（与原DNA具有序列互补性），去掉变性具有序列互补性），去掉变性条件后复性形成双螺旋结构的过程。条件后复性形成双螺旋结构的过程。核酸的理化性质核酸的理化性质l分子杂交的种类分子杂交的种类 Southern Blotting：检测：检测DNA Northern Blotting：检测：检测RNA核酸的研究方法核酸的研究方法l 核酸的分离纯化和定量测定核酸的分离纯化和定量测定l 核酸的离心分析核酸的离心分析l 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳l 核酸的测序核酸的测序l PCRl DNA的化学合成的化学合成核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的分离纯化核酸的分离纯化要点：要点：l 利用各种核酸的特性选择合适的纯化方法（注意利用各种核酸的特性选择合适的纯化方法（注意掌握原理）；掌握原理）；l 抑制核酸酶的作用，防止核酸的降解和变性。抑制核酸酶的作用，防止核酸的降解和变性。核酸的研究方法核酸的研究方法核酸含量的测定核酸含量的测定 紫外分光光度法紫外分光光度法核酸的研究方法核酸的研究方法A260=150 g/ml 双螺旋双螺旋DNA20 g/ml 寡核苷酸寡核苷酸40 g/ml 单链单链DNA/RNA核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分离核酸琼脂糖凝胶电泳分离核酸并测定并测定DNA分子量分子量核酸的研究方法核酸的研究方法核酸测序核酸测序核酸的研究方法核酸的研究方法双脱氧终止法测定双脱氧终止法测定DNA序列序列DNA聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）PCR：体外扩增：体外扩增DNA的技术的技术核酸的研究方法核酸的研究方法必备条件必备条件核心反应（原理）核心反应（原理）核心技术核心技术核心酶核心酶