5HLA-A 、B血清学分

中国输血协会第四届输血大会杭州2006年5月11日13日投稿登记表作者或联系者资料姓名傅 敏性别女职称助理研究员单位和职务上海市血液中心免疫遗传室单位地址上海市虹桥路1191号邮编200051电话（区号021）62758027传真62092413手机电子邮件xiaoyixu317稿件分类编号6投稿方法投稿者请于2006年3月15日前将填写完整的投稿登记表连同论文摘要（粘贴或打印在右侧的表格）传真至大会秘书处（057185065851），同时，另需将论文全文及摘要电邮到lwtg。科学、教育委员会将对投稿论文摘要进行审阅，并于2006年4月10日前通知作者录用与否。被录用的稿件将根据评审专家的意见以及作者的意愿选择部分作为大会口头发言。被录取的论文摘要将推荐在中国输血杂志增刊中发表，由中国输血协会授予论文证书。大会闭幕后会将优秀论文摘要推荐给中国输血杂志编辑部，由编辑部筛选、审稿后，将刊登文章全文。若稿件被录用：希望口头发言不希望口头发言稿件要求论文摘要打印或粘贴在规定的框内（高16厘米，宽12厘米），600字左右。稿件内容分类见会议预通知。.稿件格式题目，作者（希望作为口头发言者，请在方格内打），单位，目的，方法，结果，结论；.打印字体中文：宋体四号，全角；字间距：标准；单倍行距；段落间不空行。被录用为口头发言的来稿应由作者或其代表根据大会秘书处的通知在相应的分组活动中发言，作者自备中文投影（或幻灯）。论文摘要HLA-A 、B血清学分型与基因分型结果的比较傅敏 杜可明 季芸 杨剑豪 嵇月华 孙继丽 孙瑛 金晔 张铮 谢军华（上海市血液中心 200051）摘要：目的：分析血清学分型和基因分型对HLA-A、B分型结果的差异。 方法：采用PCR-SSO方法对需骨髓移植的病人进行HLA-A、B基因分型，同时用微量淋巴细胞毒试验进行血清学分型。 结果：691例样本中有88例血清学分型与PCR-SSO分型不符（12.74%），其中2例A、B都不符合，19例HLA-A不符（2.75%）：假阴性7例（1.01%）；假阳性4例（0.58%）；错误指认特异性8例（1.30%）。71例HLA-B不符（10.27%）：假阴性17例（2.39%）；假阳性15例（2.17%）；错误指认特异性39例（5.64%）。结论：与基因分型相比较，HLA-A、B血清学分型结果存在错误，基因分型结果比血清学分型的更准确。HLA-A 、B血清学分型与基因分型结果的比较傅敏 杜可明 季芸 杨剑豪 嵇月华 孙继丽 孙瑛 金晔 张铮 谢军华上海市血液中心 上海 200051摘要：目的：分析血清学分型和基因分型对HLA-A、B分型结果的差异。 方法：采用PCR-SSO方法对需骨髓移植的病人进行HLA-A、B基因分型，同时用微量淋巴细胞毒试验进行血清学分型。 结果：691例样本中有88例血清学分型与PCR-SSO分型不符（12.74%），其中2例A、B都不符合，19例HLA-A不符（2.75%）：假阴性7例（1.01%）；假阳性4例（0.58%）；错误指认特异性8例（1.30%）。71例HLA-B不符（10.27%）：假阴性17例（2.39%）；假阳性15例（2.17%）；错误指认特异性39例（5.64%）。结论：与基因分型相比较，HLA-A、B血清学分型结果存在错误，基因分型结果比血清学分型的更准确。关键词：HLA-A、B ；PCR-SSO；血清学分型Comparison of the results of genotyping and serological typing in HLA class A/B LOCUSAbstract: Objective: To analyze the discrepancy between the results of molecular and serological HLA-A、B typing. Method: HLA-A、B alleles of patients who need to marrow transplant were genotyped using the PCR-SSO (sequence specific oligonucleotide) method, and compared with the results of serological typing. Results: 88 of the 691 individuals showed a discrepancy, account for 12.74%, 2 of 88 samples showed both an HLA-A and an HLA-B discrepancy. 2.75% of the discrepancies at the HLA-A locus， 1.30% by antigen misassignments，1.01% by false negative and 0.58% by false positive. 10.27% of the discrepancies at the HLA-B locus，caused partly by antigen misassignments ，account for 5.64%, partly due to false negative and false positive， account for 2.39% and 2.17% respectively. Conclusion: Compared to HLA A、B genotyping, the results of HLA-A、B serological typing were incorrect, genotyping was more accurate than serological typing.Key words: HLA-A、B；PCR-SSO ；serological typing.HLA-区位于第6号染色体短臂上，它的外显子编码HLA-I类分子重链的1，2和3功能区，具有高度的多态性。已命名的HLA-A位点349个，B位点629个；相应血清学特异性A位点28种，B位点59种1。HLA配型是骨髓移植挑选供者必须进行的检查项目。HLA-I类抗原与移植排斥反应有很强的关联，分型结果正确与否直接影响了移植物的存活、移植后的并发症和移植成功率1。本文旨在比较血清学分型和基因分型的结果差异，分析血清学结果的错误率。1. 材料与方法1.1 标本来源2000年1月至2003年6月，上海各医院送检的临床组织配型患者共计691名1.2 HLA-AB基因分型1.2.1 DNA提取 采集EDTA抗凝的外周血5ml，用QIAGEN试剂盒（GmbH公司，德国）提取的DNA终浓度调整为3050ng/l，1.71.91.2.2 基因扩增与分析 采用SSO分型试剂盒（DYNAL公司，美国），按说明操作。扩增产物杂交后进行仪器判读。1.3 HLA-AB血清学分型 微量淋巴细胞毒试验：取抗凝血样5ml用PBS 1:1稀释，用淋巴细胞分离液分离出白膜层，然后用PBS洗涤2次后，加入Terasaki 保存液2-3滴，最后按One Lambda公司的血清学分型盘说明书进行抗原抗体反应，显微镜下计分。2 结果2.1 691例需骨髓移植的样本中有88例血清学分型与基因分型结果不符，占12.74%2.2 血清学结果错误中，HLA-A假阴性（未能检出某抗原）（7/691）占1.01%，假阳性（4/691）占0.58%，（见表1）2.3血清学结果错误中，HLA-B假阴性（17/691）占2.39% ，HLA-B假阳性（15/691）占2.17% ， (见表1)2.4血清学错误指认特异性HLA-A（8/691）占1.30%，HLA-B（39/691）占5.64%（见表2）2.5 HLA-B的错误率比HLA-A高，为HLA-A的2.11倍表1 HLA-A B假阴性及假阳性次数(n=691)A位点假阴性假阳性B位点假阴性假阳性A11B181A23B211A111B271A242B371A301B381A311B4621A681B471A691B481B491B512B521B531B551B6129B621B711B752B761表2 部分错误指定特异性情况血清学A位点基因A位点血清学B位点基因B位点33333027582762231230276227621123112475575522424373573523313124354635463111113013551355224234134613462313131352135223323358615860211211486048612-2-4875758133333027582762233233587558462292297606081224224486048612-2-38515167224224386262392-2-3861613911-11-51605161211211607560462112115467545531333133387575182112115471546324262426445444552242245459546724-24-6061614811241124276027612242243551517531333133755151621133113358615860311311355935622262265255526224332433405858612632263252616151112411243575755111331133395539712631263151725162243024303560605312612662776249注：斜体为基因分型与血清学分型方法结果的差异 3 讨论HLA配型是骨髓移植挑选供者必须进行的实验。HLA-I类抗原与移植排斥反应有很强的关联，分型结果正确与否直接影响到移植后的成功率和并发症 2。自1964年以来，HLA-A、B的分型一直用微量淋巴细胞毒试验。但由于血清学分型方法本身的局限性，例如难鉴定出所有WHO认可的特异性，难获得高质量单特异性抗血清；结果易受到交叉反应、细胞活力低、细胞表达水平、人种和民族背景、人为误差等因素的影响3 ，限制了它的进一步使用。因此，近年来国内外对HLA-A、B分型逐渐转向DNA分型。PCR-SSO技术以DNA为样本进行HLA-A、B分型，它的准确性高，需血量少，相关试剂为人工合成，不受稀有血清、细胞活力和细胞表达水平的限制，相对快捷且易掌握因而被广泛应用。本研究对691例病人样本同时进行PCR-SSO分型与血清学分型并将实验结果进行比较。结果显示血清学误定型有3种类型：1.假阴性 2.假阳性 3.错误指认特异性。HLA-A、B血清学分型与基因分型结果不相符88例次，其中HLA-A不相符（19/691）占2.75%，HLA-B不相符（71/691）占10.27%，HLA-A、B均不相符2例。在HLA-A不相符的19例中，假阴性（7/19）占36.84%，假阳性（4/19）占21.05%，错误指认特异性（8/19）占42.11%。在HLA-B不相符的71例中，假阴性（17/71）占23.94%，假阳性（15/71）占21.13%，错误指认特异性（39/71）占54.93%。与基因分型结果比较，国外文献报道HLA-I类血清学分型不符合率为5%-25%的4 ，国内吴晓冬5等报道HLA-类错误率为2%，武大林6等报道HLA-A错误率为23.5%，B错误率为26.5%，本研究结果与国内外报道的基本一致。 本实验血清学分型与基因分型不符合主要是错误指认特异性的因素（42.11%与54.93%），在HLA-A中假阴性的比率也颇高，达到了36.84%。根据HLA-A、B各自数据来看，HLA-B比HLA-A不相符率高（10.27%比2.75%）此结论与国外研究结果7相符，这可能由于在血清学分型中，HLA-B特异性种类多，分布广，因此比HLA-A容易出现指定错误。血清学分型出现假阴性的原因一般有以下几种：试剂抗血清没有和抗原反应；使用的其它试剂没有和抗原反应；目的抗原被同一交叉反应组内另一抗原掩盖；细胞活力较低，影响实验结果。在本研究中容易出现假阴性的抗原是A2、A24、A1、A69、 B61、B52、B51等。而假阳性容易出现的抗原是A11、A30、A31、A68、B61、B75等（见表1）。 本实验中有1例样本由于细胞活力原因而将B53漏检。这可能是因为本实验的691份样本均来自需骨髓移植的病人，所以不排除患者自身健康水平的因素和在治疗过程中进行放、化疗等因素导致细胞免疫功能降低，致使HLA抗原表达减弱，。可见，血清学分型如果细胞活力受影响也会导致实验结果差错，重复性较差，因此受自身因素如标本中细胞活力、数量、和药物使用等影响，对实验时间、温度的限制也相对较多。血清学分型出现假阳性的原因一般有以下几种：反应时间过长，细胞已经死亡，血清质量问题引起的交叉反应。 本实验中容易出现假阳性的是A11、A30、A31、A68、B61、B75等，特别是B61达到9例次，其中有5例次另一个B位点是B60。在HLA-B，B40的裂解产物B60与B61有强交叉反应，容易出现干扰。所以在错误指出特异性的比率中也以这两个位点最高，类似情况也出现在B15的裂解产物B62与B75上。因此，在使用血清学方法进行分型时，如果遇到此类容易发生错误的位点（见表2），判读时应该注意，如果条件允许，最好进行基因分型。 经过本次实验，充分证实与基因分型结果相比，血清学分型存在相当高的错误率，如果仍然使用此分型技术势必会对供者筛选造成错误，而导致严重的后果，因此若要提高准确率和可比性，就必须使用基因进行分型。但须提醒的是，基因分型有时不能完全代表表型，而血清学复杂的反应格局能客观地反映不同HLA分子的表位8，因此实际工作中应以基因分型技术和血清学分型方法相互结合，互为补充。参考文献1. 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