微卫星引物筛选步骤

1进行酶切用VspI对四种鱼(GC、GS、NL和ZZ)基因组DNA (需基因组DNA浓度较高)进行酶切。反应体系为：ddH2O15ALVsp Ibuffer2PLVsp I 酶1ALDNA2AL总体积20 AL酶切在37C反应34h即可，但是为了提高酶切效率可切46h。PCR 反应程序为：94C 5min, (94C lmin, 53C lmin, 72C lmin) X30, 72C lOmin, 4C hold。Vsp I酶即(Ase I酶)：酶切识别位点为：5 A T ； T A A T 35 T A A TfT A 3Ase I酶的接头为：Al：5CTC GTA GAC TGC GTA CC 3A2：5TAG GTA CGC AGT C 3Ase I酶用的预扩增产物为：A3：5CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 32接头制备用 10AL Al (200AM)和 10AL A2 (200AM)混合，94C 3min 后室温放置 30min。3酶切片段与接头连接接头为Al和A2制备的接头，命名为AE。连接反应体系如下：ddH2O5ALT4 ligation 酶0.5ALT4 buffer4AL酶切产物20ALATP(10mM)0.3ALAE1AL总体积30.8AL上述混合体系在16C连接过夜。10h左右。4 连接产物PCR扩增对连接产物进行PCR扩增，每个样本做4管。扩增引物为A3。反应体系如下:ddH2O14AL10Xbuffer2.5ALMg22ALdNTPs(10mM)0.5ALA3lALDNA (连接产物)5ALTaqE(2.5U/AL)0.2AL总体积25.2ALPCR 反应程序为:(94C 30sec, 56C lmin, 72C lmin) X20, 72C lOmin, 4C hold。 5.检测扩增产物扩增产物大小应在750bp左右，即400lOOObp较好。6回收扩增产物将同一样本的扩增产物收集于一个EP管中向其中加入1/10总体积预冷的3M NaAC和2倍体积预冷的无水乙醇（或者等体积预冷的4MNH AC和2倍体积预冷的异丙醇）420C放置30min （该步可在一20C长期保存）室温，12000rpm 离心 10min弃上清，加入1ml左右70%乙醇洗涤一次室温，12000rpm 离心 5min弃上清，干燥后加入20ALddH2O溶解即可（可以根据沉淀量加入ddH2O）7配杂交体系取250500ng回收DNA与508Opmol bio-SSR探针混合，使SSC和SDS终浓度分 别为4.2XSSC和0.07%SDS。具体杂交体系如下：ddH2O74.5AL20XSCC21AL10%SDS0.7AL回收产物3ALbio-SSR 探针（AC）150.8AL总体积100 ALPCR反应程序为：95C 5min,在58C可以保存，但是不能时间长。在此过程中可以准 备磁珠。bio-SSR探针序列可以为（AC） 、（AC） 、（AC）或者AG重复均可，这个可以根据基101512因组序列确定。8磁珠准备1）2mg beads （200L）（根据DNA沉淀的多少决定所用磁珠的量，在100200AL之间，在解冻磁珠时应轻柔的上下颠倒，不能用力）放置在磁力架上，使其吸附到EP管的 一侧，然后从另一侧吸弃清液，再加入1mLTEN100洗涤，轻柔颠倒混匀，使磁珠和TEN100 充分混合2min左右，然后放到磁力架上吸附，如此反复3次即可。2）用40ALTEN100溶解最后一次聚集的磁珠。3）为减少特异性吸附向上述混合液中加入2AL与之无关的基因组DNA（如植物基因组）。 9吸附1）将杂交体系与稀释的磁珠混合，再加入200ALTEN100稀释。2）室温放置30min，期间轻柔混合（不能用力过猛，因为该过程是目的片段与探针吸附）。 10洗涤（去掉多余DNA和杂质）将吸附好的磁珠放到磁力架上去除上清。D松弛型洗涤：400ALTEN1000洗涤3次，每次5min，加入TEN1000后轻柔混匀。2）严谨型洗涤：12ML20XSSC+12yL10%SDS + 1176yLddH2O, 400AL/次，洗涤 3 次， 每次5min,其间需轻柔混匀。（使SSC终浓度为20%，SDS为0.1%）。11洗脱1）第一次洗脫：在磁力架上弃上清液，向磁珠中加入50ALTE, 95C 5min后迅速取出 将上清液吸入另一个管子中（若温度降低那么则会复性），放入一20C保存。2）第二次洗脱：向第一次洗脱后的磁珠中加入12AL 0.15M NaOH,洗脱20min后，将其放在磁力架上，取一侧清液，向清液中加入1.8AL 1M HCL，再加入 36.2ALTE，总共50AL后，放入一20C保存。3）洗脱产物回收：分别对两次洗脱后的产物进行回收。分别向两次洗脱后的产物加2MYtRNA, 50AL预冷的4M NH4Ac以及100AL预冷的异丙醇，放入 20C 30min以上（也可以长时间保存）。然后12000rpm离心1 Omin 后弃上清，（应特别注意因为几乎看不到沉淀，所以注意小心将弄丢）， 再加入70%乙醇洗涤一次，再12000rpm离心5min，弃上清。4）将沉淀干燥后溶于20MLddH2O中。12扩增洗脱后回收的产物扩增上一步中的回收产物，NL1st，NL2nd； GS1st和GS2nd各扩增4管。PCR反应体系为：ddH2O13.6AL10Xbuffer2ALMg21.2ALdNTPs(10mM)0.4ALA30.8ALDNA （回收产物）2ALTaqE (2.5U/AL)0.2AL总体积20ALPCR 反应程序为:94C 5min, （94C 1min, 53C 1min, 72C 1min） X30, 72C 10min， 4C hold。检测扩增产物，最好在750bp左右，即4001000bp均可。13 回收PCR扩增产物将所扩增的有目的带的产物加入到一个EP管中，加入总体积1/10体积的3M NaAc和 2倍体积预冷的无水乙醇（也可以用等体积4M NH4Ac和2倍体积的预冷异丙醇， 但是NH4Ac会去掉小片段，而NaAc不会），20C放置30min以上室温，12000rpm 离心 1 Omin弃上清，加入1ml左右70%乙醇洗涤一次室温，12000rpm 离心 5min弃上清，烘干后，沉淀溶于20LddH2O中。14与载体连接在EP管中配制连接混合液，总体积为10AL。PMD18-T Vector0.5ALInsert DNA1ALddHO23.5PLLigation Solutionl5AL总体积10AL上述混合液在16C连接过夜。其中，PMD18-T Vector用 0.51AL 均可，Insert DNA 在 0.10.3pmol, 般加入 1AL, 这些都根据DNA的量确定。Ligation Solution I应在冰上溶解。15连接产物的回收取出连接产物，向10AL反应体系中加入2MYtRNA+12AL预冷的4M NH4Ac+24AL 预冷异丙醇，混匀后一20C沉降30min以上。（YtRNA的作用是帮助沉淀，因为连接产物较少所以要加入助沉剂Yt RNA）室温，12000rpm 离心 1 Omin弃上清，加入500AL （根据DNA量多少加）70%乙醇洗涤一次室温，12000rpm 离心 5min弃上清，烘干后，沉淀溶于5ALddH2O中。16电转化电转化杯和电转化细胞在冰上预冷。1.向每管连接产物回收液中加入50AL电转化细胞，用枪混匀放在冰上。 2把混合液加入电转化小杯中心的孔隙中，放到冰上。3. 用纸擦干小杯，用1500V电压在电转化仪上进行电击（电击时间长短是根据DNA量确 定的，机器自己会控制）。4. 转化后，每个小杯中加入900AL液体LB （不加氨苄），用枪头吹打以便使其和转化细 胞混匀。5取出所有液体加入1.5mLEP管中，170rpm, 37C摇1h。6清洗电转化小杯，避免接触金属面，分别用ddHp 70%乙醇和无水乙醇各清洗3次。7.取出摇好的菌液后，适当稀释涂板，30AL菌液+ 370AL液体LB,然后涂2个板子， 每个板子200AL。在37C培养过夜。接头序列：ATTAGGTACGCAGTCTACGAGCTCGTAGACTGCGTACCTAAT5B：AATGGGAAAGGCACAACTACAAGTCCCAGAATGCAAAGTGCTGTTGGCTAAAAAGCC AGGATTGGCTGAAGGTGTCACACATGACATGGGGCCACTTGGCAGTTTAGCACAGCTC CGAAAAGGGCTTTTGGTGCCAAGGATGGGTATTCCTCTGAGAACATTTGTGCCTGAATT TTGGCGAAAAGTACCCCTGGTCAGAGCTACAGAGCTGGTGTGTGAACTGCCCTGGTG AACGTTTCATCTCTACTCTGCACCACATAGTGGCTGGGGTTTTCCCCACACTTTTTACTC AGTGCAACATTAGCCTTGTGATTTGTTTTTCTCAGTAGTGTAAAAACACAGTTCTTCAG ATTCCAGGTTGCTTCACTTGTGGTTGTTCCTCTGCTCCCTGGTGACTTTGCTTAGAAGC TCCAGTATTACAAAGATTGTACATGCACCTCTATCTAGCCCTCTTTGTTCCTCTACTGA TGTTTTTCTGTTGGTGTCTCACTTGATCTGTCTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCAT CACTCTCTTTCTCCAGCATCATACTTGCTCACTCCACAAATCCTCCCATCTCTCTCTCAC ACAGTCTCTCTCCCTCTCTCAATCTGTCTTTTTTTTTGTGGTGTTTTGACGCGTGCATGACCCCAAGATTGGGGTATCGGCCAGCGCAGTTTAA矗qi闺meMotifNo.ofSSR erkl5B-1tc11606527604RatingSe| HoLeiij|tliTmPCGC4oAGcalsJtnolActivity【阳4DSense100352055.3EM-37.23=5.1Aiiti-sense100230?055.350.0-37.?31.2Product8819GS5.544%-HairpinDimerFalse PrimingCross：DimerNo Hairpins FoliikISenseNoneNoneNoneFoundAiiti-senseNoneNoneNonePl： 5 CTCCCTGGTGACTTTGCTTA 3P2： 5 GATGGGAGGATTTGTGGAGT 3SsrttPrimer5.0微卫星分子标记筛选方法综述摘要：微卫星是一种短的串联重复序列(short tandem repeat, STR)或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)。它作为一种重要的分子遗传标记，能较好地反映物种的遗传结 构和遗传多样性变化，被广泛应用于实验动物的研究。本文概述了获得和富集微卫星 位点的常用方法。最简便、最省时的方法是从从公共数据库(如 Genbank、EMBL、 EST数据库等)或已发表的文献中查找到微卫星位点，但只限于已经有序列数据发布 的物种；第二种方法是种间转移扩增，即从相近物种的数据库中查找微卫星位点，或 使用已有数据发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。第三种方法是从基因组 DNA 中筛选微卫星位点，其中用于富集微卫星的方法有引物法、磁珠杂交法、尼龙膜杂交 法以及分子标记技术法。关键词：微卫星；分子标记；实验动物微卫星(Microsatellite),又称为简单序列重复(Simple Sequence Repeat , SSR)，短 串联重复(Short Tandem Repeat STR ),是以少数几个核苷酸(一般16个)为重复 单位的串联重复DNA序列。微卫星位点广泛分布于真核生物的基因组中1，在植 物基因组中平均每33 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点，而在哺乳动物中每6 Kb 存在一个20 bp长的微卫星位点2。并且SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其 呈现高度的多态性。微卫星标记共显性的特点使它能够用于研究等位基因，区分二倍 体(或多倍体)的纯合体或杂合体，这是 AFLP、RAPD 等显性标记所无法做到的。 另外，微卫星的特异性引物扩增具有良好的重复性和保真性，方便各实验室间的交流。 目前，微卫星标记已被广泛应用到基因连锁与遗传图谱构建、遗传多样性研究、谱系 和发育研究、疾病检测以及品种鉴定、亲本分析与个体、纯系检验上。 随着微卫星 标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势。但微卫星分析中引物的获得需要预先获知 核酸序列,其广泛应用受限于从特定的物种中分离微卫星位点的难度和花费。微卫星标 记分离最大的困难是引物的获得。同 RAPD、AFLP 等遗传标记不同，微卫星研究首 先需要获知位点的序列信息，以便从重复序列两端侧翼的保守序列中设计引物。因而 微卫星引物的开发是应用该技术的关键。目前已知微卫星位点的物种很有限，这是因 为微卫星位点的获得需经过克隆、杂交筛选、测序等步骤，因此需花费一定的人力、 金钱，这限制了微卫星标记的大量使用。但近年来发展起来的各种微卫星位点富集技 术已在一定程度上解决了这个问题。已有的最常用的获得微卫星位点的方法包括： 1.从公共数据库中查找微卫星位点； 2遗传距离相近物种间引物转移扩增；3从基因组DNA中筛选微卫星位点。其中，最 方便、最经济的方法就是从已发表的文献中获得微卫星引物，但该法在使用对象上， 只限于已有引物开发出的物种，而且引物的数量不会有所增加，只能停留在原有基础 上。对于近缘种引物的应用，其适用范围究竟有多大；原物种的微卫星基因座在其他 物种间转移扩增时，其多态性如何。这些问题使得在不同物种间共用微卫星引物时， 盲目性较大，可指导操作的理论依据不足。最好的途径就是从基因组DNA中筛选微 卫星位点并进行引物的开发。1 从数据库中查找微卫星位点 在上述三种方法中,最简便最省时的就是从公共数据 库或已发表的文献中查找到微卫星位点。许多微卫星研究的出发点都是公共数据库， 比如从EMBL、Genbank或EST数据库中查找微卫星位点。从这些数据库中，可通过 电子查询方式方便地获得所需要的序列或寻找已存在的微卫星引物。研究者对大量序 列进行处理，利用Clustal W等程序，根据相似性程度，剔除冗余的EST，再剔除过短 的序列（小于lOObp）和过长的序列（大于lOOObp）,再利用SSRHunter等软件搜索 获得含有微卫星的序列，并根据其侧翼序列设计引物。何蔚3等选用前人分离得到的 42 对大熊猫微卫星引物，分别用圈养大熊猫的血液 DNA和野生大熊猫的粪便DNA对其进行PCR扩增，结果表明不同标记的多态性差异 较大，并筛选出13对能较好地应用于大熊猫遗传多样性研究的微卫星引物。匡刚桥4 等利用生物信息学方法从公开发表的鳜鱼GenBank数据库中寻找多态信息含量丰富的 微卫星位点中共搜索到304条鳜鱼核酸序列，经计算机筛选和人工选择 , 最终获得 22 条含微卫星重复单元的序列，利用SSRHunter软件在此22条含有微卫星的序列中发 现30个微卫星位点，设计出17对引物，其余位点两端序列短无法设计引物。其中13 对引物扩增条带清晰，经过多态性分析，最终筛选获得6对多态性微卫星引物。徐玲 玲等从资料和GenBank中选取扩增效果好、等位基因多、均匀分布于小型猪18条 常染色体和 X 染色体上的 100 个微卫星位点合成引物，对封闭群小型猪基因组进行 PCR 扩增及条件优化，筛选出 32 个分布于不同染色体且等位基因多的微卫星位点。 近年来随着数据库中EST序列的增加，通过数据库搜寻法获得EST微卫星位点的报 道越来越多。在此基础上进行SSR引物开发也就成了一种既经济又有效的方法。许新 等从杂色鲍cDNA文库中用SSRHunter软件搜索获得173个重复序列，从中设计 93 对引物，有 78 对可以扩增，占合成总引物的 83.9%，用深圳、汕尾等 3 个群体中 挑选出多态性引物19对，多态性微卫星比例24.36%。石耀华等从马氏珠母贝cDNA 文库查找到了 268个重复序列，含微卫星的EST数占EST总数的3.48%，设计151对 微卫星引物，有130对可以扩增，占合成引物总数的86.09%，其中多态性引物45对， 占微卫星总数的34.6%。EST微卫星位于编码区，由于基因序列的保守性，EST微卫 星序列比从基因组中筛选的微卫星多态性低Eujayl比较了小麦EST的微卫星和基 因组微卫星多态性，结果发现基因组微卫星多态性（53%）远高于EST微卫星（25%）。 从数据库中查找微卫星最大的缺点是只限于已经有序列数据发布的物种。一个替代方 法是从相近的物种数据库中查找微卫星位点，或使用已发表的遗传距离相近物种的微 卫星标记。2 近缘物种交叉扩增获得微卫星引物 由于微卫星重复序列和包含引物位点 的侧翼序列在物种间具有保守性，所以某一个物种的微卫星引物可以在其相 近的物种中使用，用来检测相近物种同源位点的多态性。这样就大大地减少 了检测微卫星位点的工作量。微卫星在近缘种之间的通用性已有研究,但在属 间应用还不多。根据M. Rossetto9对近年来发表文献的总结，微卫星位点可 在物种间扩增，其多态性也相当高。Zucoloto10等利用密西西比鳄和宽吻 凯门鳄的微卫星在其他3种鳄鱼中进行扩增，扩增率均在85%以上。Ku pper11等使用的环颈鸻微卫星成功地在4种鸻科鸟类中获得扩增，平均扩 增率为75%。蔡清秀12等从从非洲象31 个微卫星位点和5个已知亚洲象微 卫星位点中筛选出 14 个勐养亚洲象的微卫星位点，其中 9 个多态位点能在 185份粪便样品DNA中稳定扩增。孙涛13等利用138条人类微卫星引物在 黑叶猴中进行筛选，得到了 23 个具有多态性的微卫星位点。其中有 7 个位 点偏离 Hardy-Weinberg 平衡， 9 个位点存在无效等位基因现象，但是各位点 之间均未检测到连锁不平衡现象，这些位点将在黑叶猴种群遗传结构的研究 中发挥重要作用。洪艳云14等选用 10 对非洲糜羚微卫星引物和 10 对绵羊 微卫星引物作为筛选普氏原羚基因组DNA微卫星位点的引物，结果发现20 对引物中有8对引物在普氏原羚基因组DNA中扩增出了多态性位点。谭元卿15等利用小鼠微卫星位点引物536对，对长爪沙鼠基因组DNA扩增出 了 313 个阳性条带，经测序分析确定130 个长爪沙鼠的微卫星位点，与小鼠 同源性为 24.3%。3 引物跨物种共用的有效程度除与其亲缘关系的远近有关外。Primmer16等对 大量鸟类微卫星交叉扩增研究的数据进行总结后提出，交叉扩增中微卫星在 来源物种中的完全重复单元数目(perfect repeat units)与交叉扩增所获得的同 源微卫星位点的多态性呈正相关。微卫星位点的重复单元数目越多，其多态 性也就越高，这表明微卫星位点的高重复单元数目在其近缘物种仍有所保 持。这意味着即使由于较远的亲缘关系使物种间交叉扩增率较低，具有较高 重复单元数目的原始微卫星位点仍有可能获得有价值的扩增产物。 值得注 意的是，仅从产物片断大小和变化上不是总能很好地确定微卫星的存在，通 过改变扩增条件用微卫星引物在物种间扩增得到产物后，仍需要通过杂交、 测序等方法确定所扩增出的条带就是所期望的产物。4 从基因组 DNA 中筛选微卫星位点 对于无法从上面两种方法获得微卫星引 物的物种，可以从基因组DNA中筛选微卫星位点。绝大多数微卫星位点是 从 100-1000 bp 的小插入片段基因组文库中通过寡核苷酸探针杂交获得的。 标准的分离微卫星位点的方法有如下步骤：提取基因组DNA；用限制性 内切酶将基因组DNA切割成小片段；凝胶电泳，回收大小100-1000 bp的 片段；将回收片段克隆，使用标记探针进行杂交；筛选出含有重复序列 的克隆；测序证实重复序列片段的存在；根据重复序列片段两端保守序 列设计引物，进行PCR扩增,检验引物的有效性；对小量样本进行预试验, 挑选出重复性好，具多态性的微卫星位点。按以上步骤，Srikwan17和Munshi-South18利用尼龙膜菌落原位杂交法分离 出6个泰国树鼩(Tupaiaglis)和5个马来西亚树鼩(Tupaia spp.)的微卫星位点。 魏 东旺19等从鲤鱼基因组DNA中筛选微卫星位点，用探针(CA)n对质粒 pGEM-3Zf(+)构建的基因文库进行杂交筛选，从2000个白色菌落中共获得阳性克隆 45 个，其中 32 个克隆中共得到 22个微卫星。从基因组文库中分离微卫星位点的传统方法在微卫星富集程度上效率很低，为 了提高微卫星位点分离的效率，在文库构建前或构建后发展了一些富集方法。 3.1 杂交法富集微卫星 杂交富集法根据所使用的介质不同可分为三种：磁珠法、尼龙 膜法和亲和素超滤离心法。3.1.1 磁珠富集法 磁珠富集法的基本原理是用生物素标记重复序列寡核酸探 针并与基因组 DNA 酶切片段杂交，再利用生物素与亲和性强的特性，使两者相互 作用的稳定性和强度即使在变性、杂交、洗脱等操作过程中也不产生分离，从而完 成对重复序列目标片段的富集，建立微卫星富集文库。经过磁珠富集后使获得的具 有重复序列片段的效率大幅度提高。目前，链亲和素包埋的磁珠已被广泛应用到各 种微 卫星富集方法中。磁珠杂交的微卫星富集过程是在文库构建前，一般步骤如下：限制性内切酶酶 切基因组DNA，酶切后的DNA片段1000 bp；接头连接酶切DNA片段；酶切位 点和接头作为引物结合位点，进行扩增，增加DNA片段量；生物素标记的互补微 卫星寡核酸探针同PCR扩增产物杂交；链霉素包埋的磁珠杂交筛选目的片段；目的 片段洗脱、扩增、纯化、克隆；阳性克隆进行DNA测序，设计引物进行PCR分析； 多态性鉴定。 于颖20等通过磁珠富集法构建了藏鸡基因组微卫星富集文库，从 1200个转化子中获得了353个阳性克隆，随机挑选53个测序，根据测序结果成功 设计了18对藏鸡微卫星引物，最终筛选出6个具有多态性的微卫星标记。袁慧21 等用磁珠富集法构建了岩原鲤AC重复和GATA重复的微卫星富集文库，阳性克隆 率分别为30%和7%左右。对40个AC重复的阳性克隆和30个GATA重复的阳性 克隆测序，共获得61 个微卫星序列。朱亮22等法应用磁珠和生物素标记的微卫星 探针与豚鼠基因组酶切片段杂交，捕获200- 1000bp含有微卫星序列的DNA片段， 克隆构建富集微卫星序列的小片段插入文库然后用PCR法进行筛选，结果从约2000 个转化子中获得240个阳性克隆对其中98个进行了测序，并成功设计豚鼠微卫星引 物17对。WANG23等采用磁珠富集法建立黑斑狗鱼微卫星富集文库，然后利用Y -32 P 标记的放射性同位素探针进行第二次杂交，得到的阳性克隆为 1300 个，占 87.25%，从中挑出 196 个进行测序， 192(97.96%)个含有微卫星序列。赵亮24 等为促进大银鱼保护遗传学的开展，采用磁珠富集微卫星序列技术，提高了微卫星 位点的筛选效率，成功获得6个具有多态性的(CA) n重复序列的大银鱼微卫星位点。 李齐发25等用链亲和素磁珠亲和捕捉与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针 (CA) 12、(CCG) 8、(CAG) 8、(TTTC) 8 退火结合的含有接头和牦牛微卫星序列的单链限 制性酶切片段，首次成功构建牦牛基因组微卫星富集文库。测序结果发现，阳性克 隆率为77 %(37/48)，说明构建的牦牛基因组微卫星富集文库是一个高质量的文库。 闫守庆26等将貉基因组DNA酶切片段与MboI连接头连接，连接产物与生素物标 记的(AC) n微卫星探针变性及退火，再通过链亲和素偶联磁珠亲和捕捉，经吸附、 洗涤、洗脱、PCR扩增，连接转化构建微卫星富集文库，经测序分析表明该文库含 重组克隆约2800个，阳性克隆71.4%。李新国27等以日本扁柏4个种源的DNA 样品为材料，与含有生物素标记的(CT) 15探针杂交，再用磁珠富集杂交产物，成功 地实现了日本扁柏核基因组微卫星的高效分离，共获得2200多个阳性克隆，发现含 有微卫星的克隆比例高达65.6 %。3.1.2 尼龙膜富集法 尼龙膜法的主要步骤包括限制性内切酶酶切基因组 DNA；接头连接；通过吸附在尼龙膜上的许多微卫星探针来富集基因组中的微卫 星片段；洗脱结合片段，用接头作为引物进行；目的片段连接到质粒载体，转化大 肠杆菌，阳性克隆测序。战爱斌28等应用微卫星富集文库一菌落原位杂交法，用固定了 (AG)15 和 (AC)15 探针的尼龙膜( HybondN+ )捕捉含有微卫星 DNA 的片段，经洗脱、 PCR 扩增和TA克隆，构建栉孔扇贝的微卫星富集文库。富集文库中1200个重组克隆经 过菌落原位杂交后， 532个( 44.3)为阳性克隆。任意挑选100个克隆测序，结果显 示所有的克隆都至少含有一个微卫星位点。 3.1.2 亲和素和超滤离心富集法 亲和 素超滤离心法的一般过程如下：限制性内切酶酶切基因组DNA，酶切后的DNA片 段1000 bp；接头连接酶切DNA片段；酶切位点和接头作为引物结合位点，进行 扩增，增加DNA片段量；生物素标记的互补微卫星寡核酸探针同PCR扩增产物杂 交；用亲合素捕获并超滤离心浓缩富集杂交的目的片段；以富集的核酸作为模板， 反应体系和程序同前进行PCR扩增；PCR产物再次杂交、捕获、浓缩富集和扩增； 扩增产物克隆；阳性克隆进行DNA测序，设计引物进行PCR分析；多态性鉴定。 李石柱29等应用湖北钉螺基因组 DNA 的酶切片段与生物素标记的寡核苷酸探针 杂交，亲合素捕获并超滤离心浓缩富集、克隆并测序，获得湖北钉螺微卫星DNA序 列205条，GenBank注册登记号GU204044-GU204248。张丽30等应用中华白蛉基 因组 DNA 的酶切片段与生物素标记的寡核苷酸探针杂交，亲合素富集和超滤离心 浓缩目的片段，扩增放大后克隆并测序，获得118条微卫星序列，重组克隆阳性率 为78.6%。樊勇31等应用中华按蚊基因组DNA的酶切片段与生物素标记的寡核苷 酸探针杂交，亲合素富集和超滤离心浓缩目的片段，扩增放大，克隆并测序，获得252条 序列，GenBank注册登记号为EF620047-EF620298。马雅军32等对雷氏按蚊的微 卫星DNA序列进行了分离，应用雷氏按蚊基因组DNA的酶切片段与生物素标记的 寡核苷酸探针杂交, 亲合素富集和超滤离心浓缩目的片段，扩增放大后克隆并测序, 获得雷氏按蚊微卫星DNA58条，GenBank注册登记号为EF620299- EF620356。3.2 引物法富集微卫星引物法富集微卫星一般是使用同目的微卫星重复互补的寡核苷酸作为引物，通过PCR反应 在文库构建前或构建后富集微卫星位点。根据所使用引物类型的不同可分为两类：引物序列 同微卫星寡核苷酸互补以及简并性寡核苷酸引物。Paetgkau33用生物素标记的同微卫星互补的引物进行扩增克隆，单链延伸后用链亲和素包 埋的磁珠特异性选择亲和吸附。洗脱后的单链反应形成双链并转化噬菌体。用微卫星引物和 一个通用测序引物来检验噬菌斑中是否存在微卫星片段。 在 24 个阳性克隆中，全部存在 微卫星序列。Fisher34用简并性引物5 -KKVRVRV(CT)6-3富集微卫星位点。引物5端的两个碱基 V被设计成可结合到任意的核苷酸，下面5个核苷VRVRV不同微卫星序列互补，但具有最 大的简并性但不能与GA配对，因此在PCR过程中就不会在(GA) n重复区滑动，增加了 扩增的特异性。扩增的PCR产物被连接到质粒载体后转化大肠杆菌,15个阳性克隆被分离， 其中13个具有微卫星位点。3.3与分子标记技术结合3.3.1RAPD富集法 Uedo等35通 过RAPD法筛选微卫星，首先在基因组DNA中进行RAPD扩增，然后在琼脂糖凝胶上电泳 分离，片段通过 Southern 杂交转移到尼龙膜上，与标记的微卫星探针进行杂交，阳性带纯 化克隆后测序。结果表明30个克隆中， 21 个包含微卫星。该技术程序不需要建立和筛选基 因组文库。Lunt等36也采用RAPD筛选微卫星,方法是先进行RAPD扩增，然后将扩增 产物纯化后连接到质粒载体，转化大肠杆菌，用2套引物进行菌落PCR，一套是M13正向 和反向引物，另一套是 M13 引物和一个微卫星特殊性引物，将在微卫星特殊性引物扩增中 产生一条小带的克隆测序。测序结果表明分离微卫星位点的效率是传统方法的两倍。 3.3.2 AFLP富集法用链亲和素磁珠来富集AFLP片段中含微卫星的片段，是基于磁珠表面的链亲 和素与标记于微卫星探针上的生物素之间的强且稳定的共价结合。Hakki等37用AFLP从 小麦中分离微卫星位点，方法是先进行AFLP预扩增，预扩增产物与用生物素标记的微卫星 探针进行杂交和吸附，洗涤非微卫星片段后，用相应AFLP引物扩增收集到的DNA片段克 隆测序后设计引物进行微卫星扩增。 4小结 在文中叙述的三种方法中，通过公共数据库 或者已公开发表的文献获得微卫星标记是最简便易行的，但对大部分物种而言，其数量有限， 且引物多态性表现不高。近缘物种间交叉扩增，有时盲目性较大，针对性较差。但对于没有 可利用序列信息的物种，只有通过杂交等方法从物种DNA中筛选微卫星位点。通过基因组 文库获得微卫星DNA标记，效率低，工作量大。在此基础上发展而成的微卫星富集法在很 大程度上改善了这一缺点，但对实验室设备有较高的要求。利用 RAPD 和 AFLP 的方法开 发微卫星引物，需要杂交来富集微卫星序列，效率较低。 对于要应用微卫星标记进行遗传 研究的科研人员，首要面对的问题就是选择何种方法获得微卫星位点。如果是为了遗传作图， 那么就需要获得更多的微卫星 位点；如果是用来进行种群遗传研究，少量的微卫星位点就 可以满足需要。另外，技术设备也限制了对富集方法的选择，一些实验室可能没有相关的设 备进行杂交、富集、检测。同时，分离微卫星的费用也是一个考虑因素。