毒理学实验基础课件

毒理学实验基础杨春燕 2012.3.16前 言毒理学：研究外源化学物与机体有害的交互作用毒理学是一门实验科学，其研究的主要手段是动物实验。体内实验：是以实验动物为模型，通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人外推，以评估对人的危害及危险性体外实验：主要用于筛选和预测急性毒性和机制研究主要内容毒理学毒性评价实验的基本目的2动物实验的职业道德3实验动物的选择和管理4受试物样品的准备5毒理学实验设计要点67毒理学实验的统计学基础8优良实验室规范9毒理学实验的原则和局限性1实验动物染毒和处置毒理学实验的原则和局限性 01.01.01.01.基本假设基本假设基本假设基本假设人是最敏感的动物人和实验动物的生物学过程与体重（或体表面积）相关 0202.毒性试验的设计是为了最大限度的暴露化学品可能的毒性 03.03.外源化学物不同染毒途径染毒实验动物所表现的毒性差异很大化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人成年的健康实验动物和人可能的暴露途径是基本的选择实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人造成潜在危害的可靠方法Page 5动物实验的结果外推到人的不确定性实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同，甚至存在质的差别存在高剂量向低剂量外推的不确定性存在小数量实验动物到大量人群外推的不确定性实验动物对外源化学物的反应单一Page 6毒理学毒性评价试验的基本目的受试物毒作用的表现和性质剂量-反应（效应）研究确定毒作用的靶器官确定损害的可逆性动物实验的职业道德实验动物：包括所有脱离自然环境而用于研究、教学和试验的脊椎动物。所有的研究人员要尊重生命，善待实验动物。在实验中应提倡和遵循3R原则：替代replacement 减少reduction 优化refinement实验动物的选择和管理实验动物物种的选择 基本原则：1.对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种 2.选择自然寿命不太长的物种 3.易于饲养和实验操作的物种 4.经济并易于获得的物种Page 9犬、猴一般假设，如以与人相同的接触方式、大致相同的剂量水平，在两个物种有毒性反应，则人有可能以相同的方式发生毒性反应。当不同物种的毒性反应差异很大时，必须研究外源化学物在不同物种的代谢方式、动力学及毒作用机制，才可将实验结果外推到人。大鼠、小鼠实验动物品系的选择品系：是实验动物学的专用名词，指用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物品系分类：近交系、杂交群动物、封闭群Page 11开放系统屏障系统或隔离系统屏障系统隔离系统对实验动物微生物控制的选择Page 12年龄年龄年龄年龄性别性别性别性别生理状态生理状态生理状态生理状态健康状况健康状况健康状况健康状况体重选择健康动物，且动物进够后一选择健康动物，且动物进够后一般要进行检疫般要进行检疫选择未产未孕的雌性动物，且雌选择未产未孕的雌性动物，且雌雄动物分笼饲养雄动物分笼饲养一般情况选择雌雄各半一般情况选择雌雄各半个体选择实验动物的管理 在毒理学实验中所用的实验动物应有：动物合格证 实验动物生产许可证 饲养合格证 实验动物使用许可证受试物样品的准备受试物的纯度、化学结构、理化性质（挥发性、溶解性、pH值等）、稳定性（包括受试物在赋形剂中的稳定性）。对各个毒理学实验应该用同一种、同一批号受试物。试验所需受试物用量的计算 所需受试物总量=（ABCD)1.2式中：A为每组动物数，B为各处理组的剂量和，C 为染毒次数，D为动物的平均体重；1.2为安全因子，包含损耗量。试验前，应将受试物制备成一定的剂型，再进行给药。常见的剂型有溶液、混悬液、胶囊等。常用的溶剂有蒸馏水、0.5%CMC、生理盐水毒理学实验设计要点（体内实验）剂量分组 剂量反应（效应）关系，即当外源化学物染毒剂量增加时，实验动物的毒性反应（效应）随之增强。剂量反应（效应）关系的存在是确定外源化学物与有害作用因果关系的重要依据，也可证明实验结果的可靠性。Page 17 低、中、高剂量组的剂量一般按等比计算，剂量间距一般为2或出现明显有害作用出现轻微毒性不出现任何可观察到的毒性剂剂量量设设计计对照组对照组低剂量组低剂量组中剂量组中剂量组高剂量组高剂量组Page 18未处理对照组（空白对照组）阴性（溶剂）对照组阳性对照组历史性对照实验动物染毒和处置实验动物染毒在毒性实验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人在接触该受试物的方式。常用的染毒途径有：经口、经呼吸道、经皮及注射途径。不同染毒途径的吸收速率不同，一般为静脉注射吸入肌肉注射腹腔注射皮下注射经口皮内注射其他途径（如经皮等）。1.经口（胃肠道）染毒喂饲灌胃吞咽胶囊优点缺点缺点缺点优点优点稀释毒性Page 21 动式吸入染毒设备由染毒柜、机械通风系统和配气系统三部分构成将一定数量的啮齿类动物放在密闭的染毒柜中，加入易挥发的液态受试物或气态受试物使成一定浓度。将受试物注入气管，使之分布至两肺气管内气管内注入注入动式吸动式吸入染毒入染毒（口鼻、整（口鼻、整体）体）静式吸入静式吸入染毒染毒2.经呼吸道染毒 3.经皮肤染毒经皮肤染毒的目的有两种：一是经皮染毒毒性实验-大鼠、小鼠 二是皮肤刺激和致敏实验-家兔、豚鼠被毛去除方法及要求 4.注射染毒常见的注射染毒方式：静脉注射、肌肉注射、腹腔注射等。注射染毒注意问题：调整受试物的pH值，58 渗透压，最好为等渗溶液静脉注射应该控制给药速度注射前应注意注射局部消毒 5.各种染毒途径的最大容积实验动物生物标本采集及处死 1.生物标本采集 血液采集-终末、非终末采血技术 粪便采集-代谢笼采集 尿液采集-代谢笼、膀胱穿刺术 胆汁采集-插胆管 2.麻醉 麻醉过程的注意事项 在麻醉过程中，必须确定麻醉深度；对麻醉动物多个系统（如：心率、脉搏、血压、心电图、体温、呼吸频率等）仔细监测，并作出针对不同情况作出相应措施。常用的麻醉药物 短效：乙醚 中效：赛拉嗪+氯胺酮 长效：戊巴比妥钠 3.安死术 安死术：是指公认的、以人道主义方法处死动物的过程，即没有达到惊恐或焦虑而安静地、无痛苦地死亡。常用的安死术：小鼠-断头、脱颈、吸入过量CO2致死 大鼠-断头、脱颈、吸入过量CO2致死 家兔-脑定位击打、戊巴比妥钠麻醉后放血 犬、灵长类-戊巴比妥钠麻醉后放血 4.病理解剖和标本留取 大体解剖 大体解剖应在实验动物处死后半小时内进行；同时应进行主要脏器外形、大小、颜色、质地等的大体观察及记录；对指定脏器称重、计算脏器系数。组织病理学检查 对指定组织脏器取材、固定、制片，显微镜下观察，并作出正确病理诊断。毒理学试验的统计学基础良好的实验设计 统计学样本的代表性要求具有同质性，即处理组和对照组的非实验因素的条件均一性。因此，在动物分组及整个实验操作都应遵循随机化原则实验结果（指标）的变量类型 数值变量（计量资料）分类变量（计数资料）不同变量选用不同的统计分析方法统计方法的选择如果资料可拟合某些已知的分布，则适用于参数检验，其敏感度和效率高于非参数检验如资料不能拟合某些已知的分布，则应进行数据转换，以满足正态性和方差齐性如果任何变换都不能改善数据的分布，可能存在个别可疑值，应予以识别和剔除另一方面，可使用不依赖总体分布模型的非参数统计分析在评价毒理学试验结果时的3个问题是否具有统计学意义 是否具有生物学意义，即是否是真实的效应 是否具有毒理学意义，即是否是有害效应具有统计学意义是具有生物学意义的必要条件之一判断生物学意义的考虑步骤：纵向比较，此参数的改变有无剂量-反应关系。如果存在剂量-反应关系，则认为此参数的改变与受试物染毒有关具有生物学意义。横向比较，此参数的改变是否伴有其他相关参数的改变。与历史性对照比较 毒理学试验结果的统计学意义和生物学意义生物学意义生物学意义统计学意义统计学意义无有无有Page 34优良实验室规范实验方案实验实施实验计划总结报告GLP就是在科学的、全面的、全过程的严格管理和监督下，全体工作人员的自觉遵守GLP的规定，提供准确的、可信性的实验的数据和报告。GLP是优良实验室研究规范的简称