实验八 逆境处理对植物生理生化指标的影响

实验八逆境处理对植物生理生化指标的影响对植物产生伤害的环境称为逆境，又称胁迫。常见的逆境有寒冷、干旱、高温、盐渍等。逆境会伤害植物，严重时会导致植物死亡。逆境对植物的伤害主要表现在细胞脱水、膜系统受破坏，酶活性受影响，从而导致细胞代谢紊乱。有些植物在长期的适应过程中形成了各种各样抵抗或适应逆境的本领，在生理上，以形成胁迫蛋白、增加渗透调节物质（如脯氨酸含量）、提高保护酶活性（等方式提高细胞对各种逆境的抵抗能力。植物细胞膜起调节控制细胞内外物质交换的作用，它的选择透性是其最重要的功能之一。当植物遭受逆境伤害时，细胞膜受到不同程度的破坏，膜的透性增加，选择透性丧失，细胞内部分电解质外渗。膜结构破坏的程度与逆境的强度、持续的时间、作物品种的抗性等因素有关。因此，质膜透性的测定常可作为逆境伤害的一个生理指标，广泛应用在植物抗性生理研究中。当质膜的选择透性被破坏时细胞内电解质外渗，其中包括盐类、有机酸等，这些物质进入环境介质中，如果环境介质是蒸馏水，那么这些物质的外渗会使蒸馏水的导电性增加，表现在电导率的增加上。植物受伤害愈严重，外渗的物质越多，介质导电性也就越强，测得的电导率就越高（不同抗性品种就会显示出抗性上的差异。）脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加，它在一定程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物，该产物在520nm有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。该反应具有较强的专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物，碱性氨基酸对这一反应有干扰，但加入人造沸石（permutit），在PH17范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸，精氨酸等2氨基的氨基酸）。实验材料绿豆幼苗仪器设备分光光度计、水浴锅、天平、带塞试管、研钵、石英砂、漏斗、滤纸、玻棒、电导率仪、微波炉、移液管、试管、50mL小烧杯等【试剂药品】无离子水280%乙醇。3酸性茚三酮试剂：称取2.5g茚三酮，加入60mL冰醋酸和40mL6mol/L磷酸，于70C加热溶解，冷却后储于棕色试剂瓶中，4C保存，两天内稳定。4脯氨酸标准母液：称取10mg脯氨酸溶于少量80%乙醇中，再用蒸馏水定容至100mL,成lOOyg/L母液。5人造沸石、活性碳等。实验步骤取绿豆种子，用水吸胀，萌动后加洗净的河沙覆盖，放在光照培养箱中培养(25C,每天光照12h)，当苗高35cm时，即可进行干旱胁迫处理。 一盆浇充足水分作为对照，另一盆干旱处理24h。 肉眼观察伤害症状。取样和测定测相对电导率：每份取2g(地上部分)，剪成小段(1.0cm左右)，置小烧杯中，用去离子水洗三次，沥干准确加入20ml去离子水，放置1h,摇匀,用DDS-11A电导率仪测得的电导率为R1。将材料于微波炉中煮沸，彻底破坏材料的膜结构，冷却至室温后，测电导率R2。测脯氨酸含量：1脯氨酸标准曲线制作：吸取脯氨酸标准母液0,0.5,1.25,2.5,5.0,7.5,10.0,15.0mL分别放入8个50mL容量瓶中，分别加入蒸馏水定容至50mL，配成0.0，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0,20.0,30.0yg/mL的系列溶液。分别吸取上述各标准溶液2mL，冰醋酸2mL，茚三酮试剂2mL，加入到10mL带塞刻度试管中，塞上塞子，于沸水浴中加热15分钟，用分光光度计测定520nm的光密度值，以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。2.测定样品的脯氨酸含量(1)提取脯氨酸：分别称取胚轴，每种处理各取三份，每份0.3g。剪碎，加入适量80%乙醇，少量石英砂，于研钵中研磨成匀浆。匀浆液全部转移至25mL刻度试管中，用80%乙醇洗研钵，将洗液移入相应的刻度试管中，最后用80%乙醇定容至刻度，混匀，80C水浴中提取20分钟。(2)除去干扰的氨基酸：向提取液中加入约0.4g的人造沸石和0.2g活性碳，强烈振荡5分钟，过滤，滤液备用。(3)脯氨酸含量的测定：分别吸取上述提取液2mL于刻度试管中，再取一支刻度试管，加入2mL80%乙醇作为参比，分别向上述各试管中加入2mL冰醋酸和2mL茚三酮试剂，沸水浴中加热15分钟，冷却后在分光光度计测520nm处各样品的光密度，从标准曲线上查出每毫升被测样品液中脯氨酸的含量。实验结果及计算】用下列公式计算相对电导率，表示质膜相对透性：相对电导率（%）=R1/R2x100%样品中脯氨酸含量的计算:脯氨酸含量（yg/g）=（cxv/a）/w或脯氨酸含量（%）=（c*v）/a/w*106x100其中，C：由标准曲线上查得的脯氨酸微克数；v：提取液总体积（mL）a：测定液体积（mL）w：样品重（g）注意事项：质膜相对透性的测定虽简单，但干扰因素多，测定时应注意以下问题取材的一致性，代表性。器皿和用具要清洁。测试条件要一致，如测试温度等要一致。注意不同材料其适宜的浸泡时间均不相同。1 【思考题】相对电导率与细胞膜的透性之间有怎样的关系？2 相对电导率能否作为植物抗旱性的生理指标？为什么？3 以电导率或相对电导率作为抗旱性的指标，哪个更好些？为什么？4 根据实验结果，分析干旱胁迫与植物体内游离脯氨酸积累之间有何关系？5 为什么用茚三酮作显色剂要在酸性条件下起反应？目的是什么？