发根农杆菌介导的植物基因转化技术

实验名称发根农杆菌介导的植物基因转化技术成员:徐文俊,何自浩,许尚,柳其1.实验目的用发根农杆菌对黄瓜幼苗进行基因转化2.实验背景知识和原理发根状农杆菌是一种可以在双子叶植物上诱导发根症状的土壤菌,在体外，发状根表现为快速高度分枝生长这种现象的分子基础是发根农杆菌的根诱导(root-inducing,Ri)质粒上的转移DNA(transferDNA,T-DNA)转移和整合到植物细胞的基因组上Ri质粒上的T-DNA的基因表达导致发状根的形成.很多植物的发状根可再生成为植株，这种植株一般表现异常，其形态变化包括叶片皱缩、节间缩短、茎间突出、可育性下降及花型态异常.通过插入突变，已经找到了T-DNA上的4个根位点(rootloci,即rolA,rolB,rolC,rolD)参与发状根的形成.这些rol蛋白可能通过改变激素平衡或改变细胞对生长素和细胞分裂素的敏感性而影响发状根的发生过程Ri-DNA还含有章鱼碱生物合成的基因.章鱼碱是异常氨基酸衍生物或糖磷酸二酯,这些物质在转化植物组织中产生并分泌到周围环境,进而被农杆菌优先利用,从而给由于发根农杆菌具有不需任何激素而能迅速生长和分枝的特征.发状根的培养物被利用于生产次生代谢物,其他应用包括根瘤研究,人工种子生产,根和土壤,微生物相互作用的研究,及根介导的植物重金属去污染研究3.实验材料3.1仪器设备超净工作台培养室3.2材料和试剂黄瓜种子发根农杆菌A475%乙醇0.1%HgCl2无菌水MS培养基0.5mg/L的NAA,IA,BA0.1mg/LIAAYEB液体培养基20%甲醇4.实验方法4.1黄瓜种子消毒及发芽将种子在75%乙醇中浸泡3060min,转入01%HgCl2中225min,无菌水洗三次，接种于MS培养基中，在26摄氏度3000lx光强的培养室中培养试材42发根农杆菌菌株的培养挑取平板上的单菌株,，光周期为16hd,取45d苗龄的子叶及下胚轴作为接种到含有Km50mg/L,利福霉素(Rif)50mg/L的YEB培养基中,28摄氏度,160rpm过夜培养.取2O0ul接种到不含Km的YEP液体培养基中,OD600值达到0.30.5时,既可用于黄瓜的转化4.3外植体的转化从黄瓜无菌苗上切取适当大小的叶片及下胚轴切段,预培养2天，浸于OD600=0.5的农杆菌菌液中5min,取出后用多于的无菌试纸吸干多余的菌液，放回放培养基中共培养2d,转入含有Km50mg/L,Cef500mg/L的培养基中脱菌诱导发状根.4.4转基因植株GUS组织化学检测转化的发状根在37摄氏度下与GUS染色液保温48h,观察染色结果/4.实验结果和分析制作实验的ppt,