第10讲动物细胞培养生物制药II

第第1010讲讲 动物细胞培养生物制药动物细胞培养生物制药IIII本节主要内容本节主要内容1.适合大规模培养的细胞系2.动物细胞培养的生物反应器3.3.微载体及其培养特点微载体及其培养特点4.动物细胞培养的影响因素与培养工艺5.动物细胞的低温保存本节关键问题本节关键问题1.了解常用的大规模培养的动物细胞株特点2.了解适合动物细胞大规模培养的生物反应器3.重点掌握微载体培养技术4.了解动物细胞培养的影响因素及灌注培养工艺一一 适合大规模培养的细胞株适合大规模培养的细胞株1.细胞系(Cell line)是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细一种细胞胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。不能连续培养的为有限细胞系有限细胞系(Finite cell line)，能连续培养下去的为连续细胞系连续细胞系(Infinite cell line)。2.细胞株(Cell strain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或单细胞分离培养或通过筛选通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细胞，并使其在体外繁殖成为新细胞群体。毛细管法 -形成单个细胞克隆的细胞群体有限稀释法3.3.适合工业化生产的细胞株适合工业化生产的细胞株包括：原代细胞、传代细胞有限细胞系、无限细胞系（不具有接触抑制现象；理想的药物生产细胞）二倍体细胞、异倍体细胞融合细胞、转化细胞、基因工程细胞贴壁型、非贴壁型（1 1）原代细胞）原代细胞鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、血液淋巴细胞1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎组织细胞生产脊髓灰质灭活疫苗脊髓灰质灭活疫苗，开创了动物细胞培养进行生物制药的先河。具有需要大量动物组织、成本高、费时费力等缺点。药物筛选、药理研究。（2 2）传代细胞）传代细胞二倍体细胞：具有正常细胞的特点：二倍体染色体、具有贴壁和接触抑制特性、无致瘤性。有限细胞系（传代次数一般都不超过50代）。WI-38WI-38：1961年Wister 38研究所从女性高加索人的正常胚肺组织中获得的一株人2倍体细胞系WI-38。培增时间24h；贴壁生长；第一批获得批准用于生产的二倍体细胞,对病毒敏感，第一个用于疫苗（脊髓灰质灭活疫苗）生产。MRC-5MRC-5：二倍体，成纤维，生长比WI-38快。（3 3）转化细胞）转化细胞细胞转化是指细胞发生遗传改变遗传改变而产生永生永生化，即由有限性细胞系转化为连续性细胞系，可以在体外进行无限传代无限传代和生长繁殖。倍增时间短倍增时间短，对培养条件与生长因子要求低要求低。由于转化细胞常常由于染色体断裂而变成异倍体异倍体，失去正常细胞的特点，开始时由于安全性安全性不能确认而没有大量使用。随着对肿瘤发生机制等研究的深入，转化细胞于20世纪80年代获得批准用于生产。转化方法转化方法1.1.细胞自转化细胞自转化体外培养的细胞自发出现的转化现象。这种现象在许多正常二倍体长期传代过程中出现。可能的因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污染等。2.2.人工诱发转化人工诱发转化采用诱导剂使正常细胞发生转化。凡是可以改变DNA结构的因素都可以称为诱导剂，包括化学、物理和病毒诱导剂。CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)：从中国仓鼠卵巢仓鼠卵巢分离的细胞，亚二倍体亚二倍体，有多种突变株。贴壁生长，也可以悬浮培养，对剪切力和渗透压改变有较高的忍受能力。CHO细胞能表达糖基化蛋白药物糖基化蛋白药物：组织纤维蛋白溶酶原激活剂(Tissue plasminogen activator，tPA)、促红细胞生成素（Erythropoiefin，EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原（Hepatitis B virussurface antigen,HBsAg）、粒细胞集落刺激因子（Granulocyte colony stimulating factor,GCSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。BHK-21BHK-21细胞细胞（Baby hamster kidney cell）：是1961年英国从幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样，异倍体。常用于增殖病毒，制备疫苗和重组蛋白(例如重组凝血因子VIII)。VeroVero细胞细胞（Vero cell）:是1962年日本从非洲绿猴肾绿猴肾中分离的细胞。成上皮型，异倍体异倍体，贴壁型，是最常用的大规模培养的动物细胞之一。（4 4）融合细胞）融合细胞杂交瘤细胞：脾脏B细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞。无血清培养基中高密度悬浮生长。抗体药物生产。二二 动物细胞大规模培养动物细胞大规模培养1962年开始大规模培养尝试，目前已经成为生物制药的重要支撑技术。疫苗、抗体、蛋白类药物等。（一）定义（一）定义（二）转管（二）转管/瓶培养系统瓶培养系统转瓶培养是在转管培养基础上为扩大培养量而改进的。转瓶或转管固定在旋转支架上，倾斜角度一般为5-10。细胞贴附在转瓶或转管的内表面，培养液随旋转而流动，细胞交替接触营养和空气，利于细胞吸收营养、进行气体交换。（三）动物细胞生物反应器培养（三）动物细胞生物反应器培养除了以人工诱变为目的的培养外，用于动物细胞培养的生物反应器的设计原则应该是尽量模拟培模拟培养物在生物体内的生长环境养物在生物体内的生长环境。由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁贴壁、脆弱等，与微生物细胞培养不同，需要特别注意反应器结构设计以及特殊载体的选择。问题讨论：问题讨论：1.1.如何设计生物反应器，降低动物细胞培养如何设计生物反应器，降低动物细胞培养的剪切力损伤？的剪切力损伤？2.2.如何满足细胞贴壁要求又能充分利用反应如何满足细胞贴壁要求又能充分利用反应器空间体积？器空间体积？动物细胞培养的生物反应器动物细胞培养的生物反应器机械搅拌式：浆叶改造充气搅拌式：需要改造微载体培养：解决空间分布与贴壁，连续灌注培微载体培养：解决空间分布与贴壁，连续灌注培养养中空纤维式：解决贴壁、营养气体有效吸收交换、中空纤维式：解决贴壁、营养气体有效吸收交换、连续灌注培养连续灌注培养1 1、搅拌罐式生物反应器、搅拌罐式生物反应器这是最经典和最早被采用的一种动物细胞反应器，现在大多已根据动物细胞固有的特点而改造成更适于动物细胞的培养。改造的主要点改造的主要点如下如下：（1 1）由于动物细胞对氧的需求较高对氧的需求较高，因此罐体的高径比高径比（H/DH/D）一般采用）一般采用1 11.51.5：1 1，较培养微生物的罐体高径比（2 23 3：1 1）小，这有利于增大液体与空气的接触面增大液体与空气的接触面。此外，培养动物细胞的罐体要求罐底为圆形罐底为圆形，以避免细胞和细胞和载体沉积在周边载体沉积在周边。（2 2）由于动物细胞对搅拌产生的剪切力较细菌敏感剪切力较细菌敏感，因此搅拌速度一般在2020100r/min100r/min，故多数倾向于采用较大的倾斜式桨叶搅拌器倾斜式桨叶搅拌器或船舶推进式桨叶搅拌器船舶推进式桨叶搅拌器。（3 3）由于通气的气泡在破裂气泡在破裂时产生的应力可损损伤动物细胞伤动物细胞，一般采用无气泡通气系统无气泡通气系统。常用的有上述的笼式通气系统笼式通气系统，通气的气泡与细胞被笼被笼网隔开网隔开。另一种是采用聚丙烯中空纤维膜聚丙烯中空纤维膜或透气透气的硅胶管的硅胶管。采用孔径为孔径为0.33m0.33m的聚丙烯中空纤聚丙烯中空纤维膜维膜。（4 4）动物细胞培养的反应器常常需要配备有配备有进进出液体系统出液体系统，以便进行灌注培灌注培养养，并有使细胞与使细胞与培养基分离、使细胞保留在反应器内的装置培养基分离、使细胞保留在反应器内的装置。笼式通气搅拌生物反应器笼式通气搅拌生物反应器机械搅拌结合鼓气的生物反应器机械搅拌结合鼓气的生物反应器这种类型的生物反应器搅拌速度一般都非低，尽量减少剪切力对细胞的影响。2 2、气升式生物反应器、气升式生物反应器为了使培养基良好地循环和充分地混合，反应器的高径比高径比一般在一般在1010：1 1左右左右。在培养动物细胞时，为了减少因气泡气泡的张力的张力对细胞造成的危害以及由此产生的泡沫，要求通气时产生的气泡直径为气泡直径为1 12 mm2 mm，空气流量为空气流量为0.010.010.06vvm0.06vvm，该反应器主要用于悬浮细胞的分批式培养主要用于悬浮细胞的分批式培养。3、中空纤维生物反应器、中空纤维生物反应器中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜。主体是由微孔中空纤维管束制成的中空丝，纤维束由外壳包裹，因此可分为中空内腔与中中空内腔与中空外腔空外腔两部分，每部分各有其进出口。新鲜培养液从中空内腔导入。气体在管体部分通过，其中一部分则均匀地扩散至壳体内部。柱式中空纤维生物反应器柱式中空纤维生物反应器板框式板框式 中心灌流式中心灌流式模拟细胞在体内生长的三维状态。既可用于悬浮细胞悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞贴壁细胞的培养。细胞如果是贴壁贴壁性的，则附着在纤维外壳表面，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化冲出；若是非贴壁贴壁性的，应采用微滤材料将其截留在反应器内而让培养液排出。优点优点：无剪切力影响，高密度培养，传质效率高。缺点缺点：容易堵塞，价钱昂贵。(四四)动物细胞大规模培养的方法动物细胞大规模培养的方法动物细胞培养的方法根据培养细胞的种类细胞的种类：原代细胞培养和传代细胞培养：原代细胞培养和传代细胞培养根据培养基的不同培养基的不同：液体培养和固体培养：液体培养和固体培养。根据培养容器和方式的不同培养容器和方式的不同：静止培养、旋转培养、搅拌培：静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养等。从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可分为从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培悬浮培养、贴壁培养和贴壁养、贴壁培养和贴壁悬浮培养悬浮培养。1 1、悬浮培养、悬浮培养所谓悬浮培养悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。它适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞。该培养方法的优点优点是操作简便，培养条件比较均一均一，传质和传质和传氧传氧较好，容易扩大培养规模容易扩大培养规模，在培养设备的设计设计和实际操实际操作作中可借鉴借鉴许多有关细菌发酵的经验。不足之处不足之处细胞密度一般较低细胞密度一般较低。目前在生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌罐式生物反应器通气搅拌罐式生物反应器和气升式生物反应器。气升式生物反应器。2 2、贴壁培养、贴壁培养贴壁培养贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。它适用于一切贴附依赖性细胞贴附依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞。该方法的优缺点优缺点与悬浮培养正好相反，优点优点是适用的细胞种类细胞种类广广（因为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容易采用灌注培养采用灌注培养的方式使细胞达到高密度达到高密度；不足之处不足之处是操作比较麻烦，需要合适的贴附材料合适的贴附材料和足够的面积足够的面积，培养条件不易均一不易均一，传质和传氧传质和传氧较差，另一种被普遍采用的贴壁培养方法是固定床式生物反应器固定床式生物反应器，但由于该反应器中传质和传质和传氧传氧常会出现梯度式不均一现象梯度式不均一现象，故放大常受到限制放大常受到限制。3 3、贴壁悬浮培养、贴壁悬浮培养或称或称假悬浮培养假悬浮培养，悬浮培养和贴壁培养都有一定的优点和优点和不足不足，那么能否将两者结合将两者结合，优势互补优势互补，形成一种更理想的、更适于工业化大规模生产的培养方法呢？下面将介绍几种主要的使两者结合的培养方法几种主要的使两者结合的培养方法2.2.微载体培养技术微载体培养技术微载体微载体（Microcarrier）：是直径60-250m的适用于贴壁依赖型细胞生长的微粒。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。1967年，维茨尔（Van Wezel）开发了微载体系统。微载体系统将传统的一维平面贴附扩展为三维立体贴附，摆脱了传统的培养瓶（管）培养限制。同时，微载体使利用生物反应器进行动物细胞大规模培养成为可能，既能满足动物细胞的贴壁要求，又能充分利用生物反应器的内部空间。理想的微载体理想的微载体需具备的条件具备的条件微载体表面性质与细胞有良好的相容性良好的相容性，适于细胞附着、附着、伸展和增殖伸展和增殖；微载体的材料无毒性无毒性。不仅要求对细胞的生长无毒性生长无毒性，而且也不会产生影响产品和人体健康不会产生影响产品和人体健康的有害因子有害因子；微载体的材料是惰性惰性的的，不与培养基成分发生化学变化，也不会吸收培养基中的营养成分吸收培养基中的营养成分；微载体的比重在比重在1.0301.0301.045 g/ml1.045 g/ml，使载体在低速搅拌下就可悬浮，而在静止时又可很快沉降很快沉降，便于换液和收获换液和收获；粒径粒径在60250m（溶胀后）之间为好，并要尽可能地均一，差异不大于20m。这样有利于细胞均匀地分布在各微载体表面；具有良好的光学透明性光学透明性，适于在倒置显微镜下观察细胞在载体上的生长情况；基质的性质最好是软性最好是软性的，避免在搅拌中由于载体互相磨擦而损伤细胞；可耐耐121121高温高温，便于采用高压蒸汽灭菌；经简单的适当处理简单的适当处理后，可反复多次地使用；原料充分，制作简便，价廉简便，价廉。制备微载体的材料制备微载体的材料人工合成聚合物人工合成聚合物聚甲基丙烯酸-2 羟乙酯（PHEMA）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯酰胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等。天然聚合物及其衍生物天然聚合物及其衍生物明胶、胶原、纤维素、甲壳质及其衍生物、海藻酸盐。微载体分类微载体分类实心微载体实心微载体优点：易于细胞在表面贴壁，机械强度高，容易接种操作缺点：细胞浓度低；细胞容易受剪切力、搅拌、碰撞等影响；细胞易老化脱落。多孔微载体多孔微载体优点：比表面积更大，使细胞免受机械损伤，得到的细胞浓度高，可降低血清用量，可以采用高的搅拌速度和通气量。缺点：容易产生营养传递障碍，积聚代谢副产物。（1 1）微载体培养）微载体培养问题回顾：问题回顾：动物细胞贴壁生长的主要环节有哪些？动物细胞贴壁生长的主要环节有哪些？1.1.游离期：游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态悬浮态。2.2.吸附期：吸附期：不同类型的细胞的贴壁时间有所差异，多数细胞都可在24小时内贴壁贴壁。3.3.繁殖期：繁殖期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。随着细胞数量的增多，细胞间开始接触并连接成片。出现接触性抑制。4.4.退化期：退化期：细胞长满载体表面，随着营养物的消耗和代谢物的积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。如不及时传代培养，细胞脱落死亡脱落死亡。微载体培养微载体培养同样，微载体培养动物细胞也经过以上四步四步。主要是黏附黏附贴壁、生长和扩展成单层贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体微载体表面的贴附是关键表面的贴附是关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和亲和性，微载体的接触概率和亲和性，也与培养基组成、搅拌等相关也与培养基组成、搅拌等相关。影响贴壁的因素影响贴壁的因素贴壁主要是靠静电引力和范德华力静电引力和范德华力。取决于细胞与微载体表面理化性质性质和微载体接触概率接触概率有关。电荷：电荷：一般细胞在进入生理pH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。培养基组分培养基组分：添加血清血清有助于细胞贴壁。提供促促接触和伸展因子接触和伸展因子。搅拌：搅拌：不能仅依靠大的搅拌速率保证接触概率。在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min75r/min。其它因素其它因素：培养基偏酸或偏碱、微载体不洁等不利条件都不利于细胞贴壁。问题：问题：微载体培养如何收获细胞？接种微载体培养如何收获细胞？接种细胞传代呢？细胞传代呢？细胞收获与微载体再生的具体方法举例细胞收获与微载体再生的具体方法举例振荡，去除脱落的细胞及细胞碎片柠檬酸浸泡，使载体内部细胞裂解脱落碳酸氢钠碱性溶液浸泡，使细胞进一步脱落胰蛋白酶浸泡消化水洗载体，缓冲液洗涤，灭菌备用球传球接种技术球传球接种技术将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合，实现细胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体表面的技术。优点：优点：（1）避免了细胞收获与微载体再生过程，方便、高效。（2）防止细胞调亡：通过定期更换微载体也能为细胞的分裂生长提供了新的生长空间，在长期培养过程中保持细胞活力，延长了细胞寿命，提高了细胞分泌物的产量。问题讨论：问题讨论：3.3.微载体培养有哪些优点？微载体培养有哪些优点？优点优点1.模拟了体内三维生长三维生长环境，减轻了接触抑制，可以多层生长。2.很好地解决了生物反应器的空间分布空间分布问题，单位体积培养液的细胞产率高；培养系统占地面积和空间小；放大容易，使大规模培养动物细胞成为可能。3.把悬浮培养和贴壁培养融合在一起悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可以稍加改造利用传统生物反应器稍加改造利用传统生物反应器。4.接种与收获方便；可循环、连续收获与培养连续收获与培养，培养基利用率较高。（2 2）包埋和微囊培养）包埋和微囊培养该培养方法与微载体的不同之处在于细胞不是贴附在载体该培养方法与微载体的不同之处在于细胞不是贴附在载体表面，而是被包埋或包裹在凝胶载体或微囊内表面，而是被包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。有时包埋的凝胶载体较大，故又被称为巨载体培养。包埋法早期主要用于固定细菌、酵母等，近些年才被移植于动植物细胞的培养。微囊培养是在包埋培养上衍生而来的，即将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊。可以用于包埋细胞的载体材料大致有如下3类：人工合成的高分子聚合物；糖类；蛋白质。目前最普遍实用的主要是琼脂糖和海藻酸钙凝胶琼脂糖和海藻酸钙凝胶。这些材料中有的是靠温度的改变而改变物相，如琼脂糖，在高温时融化成液态，低于4537时则凝固；有的是靠离子移变而改变物相。（四）动物细胞培养的影响因素（四）动物细胞培养的影响因素1.1.细胞凋亡细胞凋亡（1 1）有毒物质或抑制因子产生氨氨：来自培养基+代谢，积聚影响细胞生长。乳酸：乳酸：来自细胞的糖代谢，抑制乳酸脱氢酶，抑制糖酵解，能量产生减少，抑制细胞生长。甲基乙二醛甲基乙二醛：脂类、氨基酸的代谢产物，对细胞有潜在的损伤作用。COCO2 2：毒性（2 2）营养成分耗尽如谷氨酰胺谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因，而且凋亡一旦发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞在无血清、无蛋白无血清、无蛋白培养基培养基中进行培养时，细胞变得更为脆弱，更容易发生凋亡。（3 3）其他物理因素渗透压、pHpH、温度、载体、搅拌等。细胞凋亡会减少细胞浓度，降低目标物细胞凋亡会减少细胞浓度，降低目标物质产量质产量问题讨论问题讨论4.4.采取怎样的工艺操作才可以消除细胞凋亡，采取怎样的工艺操作才可以消除细胞凋亡，保证高的细胞浓度？保证高的细胞浓度？1.分批培养2.流加培养3.连续培养4.连续灌注培养补充的营养成分补充的营养成分葡萄糖葡萄糖：葡萄糖是细胞的供能物质和主要的碳源物质碳源物质，然而当其其浓度较高是会产生大量的代谢产物乳酸，因而需要进行其浓度控浓度较高是会产生大量的代谢产物乳酸，因而需要进行其浓度控制制，以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳。谷氨酰胺谷氨酰胺：谷氨酰胺是细胞的供能物质和主要的氮源物质氮源物质，然而当其浓度较高是会产生大量的代谢产物氨，因而也需要进行其浓浓度较高是会产生大量的代谢产物氨，因而也需要进行其浓度控制度控制，以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳。氨基酸、维生素及其他氨基酸、维生素及其他：主要包括必需氨基酸、非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羟脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养成分如胆碱、生长刺激因子。灌注培养灌注培养1.1.减少细胞调减少细胞调亡亡（1 1）可以去除）可以去除氨、乳酸、甲氨、乳酸、甲基乙二醛等代基乙二醛等代谢物质。谢物质。（2 2）保证营养）保证营养供给。供给。2.2.连续性收获连续性收获产品产品DMEM培养基培养基胎牛血清胎牛血清其他成分其他成分锥形瓶逐级锥形瓶逐级放大培养放大培养加碱（碳酸加碱（碳酸氢钠）氢钠）加糖（葡萄加糖（葡萄糖）糖）灌注培养液灌注培养液微载体微载体5L种子罐培种子罐培养养培养液培养液50L生生物物反反应应器器接种狂犬接种狂犬病毒病毒出液口出液口收获病毒收获病毒-196-196液氮罐液氮罐普通冰箱普通冰箱低温冰箱低温冰箱-196-196液氮罐液氮罐补充文献：补充文献：课后视频：课后视频：http:/