植物组织培养的基本技术与设施

第一节第一节 植物组织培养的操作方法概述植物组织培养的操作方法概述 一、外植体的选择一、外植体的选择 二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌 三、外植体的接种和培养三、外植体的接种和培养 四、外植体的成苗途径四、外植体的成苗途径 五、污染的原因及其预防措施五、污染的原因及其预防措施 六、外植体的褐变及其防止措施六、外植体的褐变及其防止措施 七、培养物的玻璃化现象及其防止措施七、培养物的玻璃化现象及其防止措施 八、试管苗的驯化与移栽八、试管苗的驯化与移栽 J 外植体（外植体（ExplantsExplants）：）：指植物离体培养的各种接种指植物离体培养的各种接种材料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体。材料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体。一、一、外植体的选择外植体的选择J 外植体的选择依据外植体的选择依据J优良的种质优良的种质J健壮的植株健壮的植株J大小适宜的外植体大小适宜的外植体J适宜的发育时期适宜的发育时期J适宜的部位适宜的部位J适宜生理状态和发育年龄的器官适宜生理状态和发育年龄的器官J细胞培养材料的选择细胞培养材料的选择 （二）外植体灭菌的一般步骤 二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌（一）常用灭菌剂的使用及其效果（三）各种外植体的灭菌方法（三）各种外植体的灭菌方法（一）常用消毒剂（一）常用消毒剂消毒剂使用浓度（）去除的难易 消毒时间（分）效果次氯酸钙次氯酸钠漂 白 粉溴 水过氧化氢升 汞酒 精抗 菌 素硝 酸 银9102饱和溶液1210120.11707545（mg/L）1易易易易最易较难易中较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好较好好自:曹孜义（二）（二）外植体灭菌的一般步骤外植体灭菌的一般步骤 3.将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活化剂Tween20或Tween 80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须把玻璃瓶摇动23次。4消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，重复34次。1预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌。2将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。1 1、茎尖、茎段及叶片等的消毒、茎尖、茎段及叶片等的消毒消毒前要经自来水较长时间的冲洗。消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗23次，然后用2%10%的次氯酸钠溶液浸泡1025min，若材料有茸毛最好在消毒液中加入几滴吐温-80，或者用升汞浸泡消毒510分钟消毒后，用无菌水冲洗3次后方可接种。2 2、果实及种子的消毒、果实及种子的消毒用自来水冲洗1020分钟或更长，用纯酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠溶液浸 10min后，用无菌水冲洗23次。种子要先用10%次氯酸钠浸泡 2030min甚至几小时。对难以消毒的还可用0.l%升汞或1%2%溴水消毒5min。胚或胚乳培养时，对种皮太硬的种子，可先去掉种皮，再用4%10%的次氯酸钠溶液浸泡810min，经无菌水冲洗后，即可取出接种。（三）几种外植体的灭菌方法（三）几种外植体的灭菌方法 70酒精擦洗花蕾，或浸泡数秒钟饱和漂白粉上清液：浸泡10分钟；或次氯酸钠液25：810分钟无菌水冲洗几次后，吸去水分，剥取花药或胚珠接种。3 3、花药的消毒、花药的消毒 预先用自来水洗涤，再用软毛刷刷洗，且用刀切去损伤及污染严重部位，吸水纸吸干后，再用酒精漂洗。可采用0.1%0.1%0.2%0.2%升汞升汞浸5 510min10min或2%2%次氯酸钠次氯酸钠溶液浸1015min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干后可接种。4 4、根及地下部器官的消毒、根及地下部器官的消毒 三、外植体的接种和培养三、外植体的接种和培养 （一）无菌操作（一）无菌操作 （二）外植体的培养（二）外植体的培养 植物组织培养的接种：植物组织培养的接种：把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培养基上的全部操作过程，是一种无菌技术。在操作过程中引起的污染来源：污染来源：主要是由材料本身带菌和工作人员本身引起的。（一）无菌操作（一）无菌操作 污染的主要来源污染的主要来源是空气是空气中的细菌和真菌孢子中的细菌和真菌孢子每次接种前半小时每次接种前半小时地面地面：用：用7070酒精喷酒精喷雾使空气的灰尘沉降。雾使空气的灰尘沉降。紫外线灯照射紫外线灯照射2020分钟。分钟。工作台面要用工作台面要用新洁尔灭新洁尔灭或酒精擦洗或酒精擦洗。1、接种室的消毒、接种室的消毒 入无菌室前，要洗手。入无菌室前，要洗手。l%l%新洁尔灭溶液内新洁尔灭溶液内5 5分钟分钟入室时要穿上经过入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。等。操作前要用操作前要用70%70%酒精擦洗手酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒工具在火焰上消毒。必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。上。2 2、工作人员要求、工作人员要求 切取和接种切取和接种较大的材料肉眼观较大的材料肉眼观察即可操作分离，察即可操作分离，较小较小的材料需的材料需在在双筒解剖镜下双筒解剖镜下操作。操作。分离工具一定要放好，切割动分离工具一定要放好，切割动作要快，防止挤压作要快，防止挤压使材料损伤而使材料损伤而失败。失败。接种时要防止交叉污染的发生接种时要防止交叉污染的发生 3 3、材料的切取、材料的切取酒精擦拭手外植体消毒浸泡5min器械消毒酒精灯灼烧 4 4、接种的具体操作接种的具体操作旋转灼烧取外植体接种盖好瓶塞 1 1、培养条件：、培养条件：温度：温度：常保持在常保持在232322，夜温低，夜温低1212 光照时数光照时数：大多数情况下为：大多数情况下为16h16h（暗培养不需要光照，例如（暗培养不需要光照，例如起始培养的前几天不需要光照）起始培养的前几天不需要光照）光照强度光照强度：1000300010003000lxlx，白色荧光灯，光的作用是满足，白色荧光灯，光的作用是满足形态建成的需要（诱导）形态建成的需要（诱导）相对湿度：相对湿度：培养室的相对湿度一般不控制。根据需要适当培养室的相对湿度一般不控制。根据需要适当调整培养间湿度调整培养间湿度 （二）外植体培养（二）外植体培养 接种后37天内，主要是检查其污染情况。增殖、继代培养，建立了无菌培养系。细胞学观察：一般每隔35天观察一次。及时记录。观察方法根据培养方式灵活掌握：可用显微镜进行定点观察如平板培养可用倒置显微镜观察如液体培养2、定期检查和细胞学观察、定期检查和细胞学观察 1 1外植体先形成愈伤组织，再分化成完整外植体先形成愈伤组织，再分化成完整 的植株。的植株。四、外植体的成苗途径四、外植体的成苗途径 2胚状体发生胚状体发生3 3外植体经诱导后直接形成根与芽，发育外植体经诱导后直接形成根与芽，发育成完整的植株成完整的植株4 4原球茎型原球茎型-图片图片石斛兰的原球茎石斛兰的原球茎外植体愈伤组织 根、芽芽根根芽胚状体根、芽试 管 苗外植体的成苗途径外植体的成苗途径 不定芽形成-多细胞参与胚状体形成过程-单细胞参与体细胞胚的发育过程 低CTK/IAA外植体愈伤组织芽根脱分化再分化低CTK/IAA根 完 整 植 株生长调节物质控制器官分化的模式生长调节物质控制器官分化的模式芽高CTK/IAA低CTK/IAA五、污染的原因及其预防措施五、污染的原因及其预防措施 污染污染 概念：是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。概念：是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。原因：原因：细菌细菌菌斑呈黏液状物。菌斑呈黏液状物。除材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染外，操作人员的不慎除材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染外，操作人员的不慎也是造成细菌污染的重要原因。因此接种人员的手应经常用也是造成细菌污染的重要原因。因此接种人员的手应经常用 70酒精擦净，镊子和接种酒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。针在使用前必须在火焰上烧红。真菌真菌污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3 310d10d才能发现，才能发现，造成真菌污染的原因多为周围环境的不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养瓶的造成真菌污染的原因多为周围环境的不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养瓶的口径过大、操作不慎等口径过大、操作不慎等途径：途径：外植体带菌；外植体带菌；培养基及器皿灭菌不彻底；培养基及器皿灭菌不彻底；操作人员未遵守操作规程等。操作人员未遵守操作规程等。防止材料带菌的措施防止材料带菌的措施 用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。避免阴雨天在田间采取外植体。避免阴雨天在田间采取外植体。对于材料内部污染的材料采取特殊方法。对于材料内部污染的材料采取特殊方法。外植体的灭菌外植体的灭菌 多次灭菌法多次灭菌法 多种药液交替浸泡法多种药液交替浸泡法金属器械的灭菌金属器械的灭菌一般用火焰灭菌法，即把金属器械放在一般用火焰灭菌法，即把金属器械放在 9595的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。金属器械也可以用干热灭菌法灭菌，即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，金属器械也可以用干热灭菌法灭菌，即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。放在烘箱中灭菌。布质制品的灭菌布质制品的灭菌:工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的布质品，放入高压灭菌器中，在压力为108kPa，温度为121的情况下，灭菌2030min无菌操作室的灭菌无菌操作室的灭菌:无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2的新洁尔灭或 70的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使用前用70的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。操作人员操作人员 污染的预防措施污染的预防措施六、外植体的褐变及其防止措施六、外植体的褐变及其防止措施 （一）褐变的原因（一）褐变的原因 1.1.基因型基因型 2.2.外植体的生理状态外植体的生理状态 3.3.培养基的成分培养基的成分 无机盐浓度；植物生长调节物质；外植体脱分化条件；转无机盐浓度；植物生长调节物质；外植体脱分化条件；转移时间过长。移时间过长。（二）褐变的防止措施（二）褐变的防止措施 1.1.选择适宜的外植体选择适宜的外植体 2.2.最佳培养基最佳培养基3.3.连续转移连续转移 4.4.加抗氧化剂加抗氧化剂 5.5.活性炭活性炭 七、培养物的玻璃化七、培养物的玻璃化现象及其预防措施现象及其预防措施 （一）玻璃化现象（一）玻璃化现象 叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。低。激素浓度激素浓度 激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比例高生长素比例高)。琼脂浓度琼脂浓度 琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重。琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重。温度：温度：适宜的温度可以使试管苗生长良好。适宜的温度可以使试管苗生长良好。光照时间光照时间多数植物在多数植物在101012h12h光照下都生长良好，大于光照下都生长良好，大于15h15h时，玻璃化时，玻璃化苗明显增加。苗明显增加。通风条件通风条件愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。愈伤组织和试管苗长时间培养，不能及时转移，容易出现玻愈伤组织和试管苗长时间培养，不能及时转移，容易出现玻璃化苗。璃化苗。组织培养所用瓶盖棉塞、滤纸、封口纸、牛皮纸通气较好，组织培养所用瓶盖棉塞、滤纸、封口纸、牛皮纸通气较好，玻璃化苗的比例较低。玻璃化苗的比例较低。离子水平离子水平培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。例就会增加。（二）产生玻璃化苗的因素（二）产生玻璃化苗的因素 适当控制培养基中无机营养成分；适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度；适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度；增加自然光照，控制光照时间；控制好温度；改善培养器皿的气体交换状况在培养基中添加其他物质，加入间苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化。如添加马铃薯汁液法可降低油菜玻璃苗的产生频率；L多效唑或10mgL的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生；的聚乙烯醇防治苹果砧木玻璃化。加入 的活性炭还可降低玻璃苗的产生频率。（三）预防措施（三）预防措施 J 试管苗的特点试管苗的特点J 试管苗的驯化试管苗的驯化 J 试管苗的移栽试管苗的移栽J 提高试管苗移栽成活率的途径提高试管苗移栽成活率的途径 八、八、试管苗的驯化与移栽试管苗的驯化与移栽（一）、试管苗的特点（一）、试管苗的特点 试管苗的生态环境试管苗的生态环境 高温且恒温；高湿；弱高温且恒温；高湿；弱光；无菌。光；无菌。试管苗的特点试管苗的特点 试管苗生长细弱，茎、试管苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达；叶表面角质层不发达；试管苗茎、叶虽呈绿色，试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光合作用较但叶绿体的光合作用较差；差；试管苗的叶片气孔数目试管苗的叶片气孔数目少，活性差；少，活性差；试管苗根的吸收功能试管苗根的吸收功能弱。弱。试管苗和普通苗的根解剖比较蓝莓蓝莓（二）、试管苗的驯化（二）、试管苗的驯化 驯化的目的驯化的目的:在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，促使试管苗健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。力，促使试管苗健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。驯化的原则：驯化的原则：应从温度、湿度、光照及有无菌态等环境要素进行，驯化开始数应从温度、湿度、光照及有无菌态等环境要素进行，驯化开始数天内，应和培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的栽培天内，应和培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的栽培条件相似，从而达到逐步适应的目的。条件相似，从而达到逐步适应的目的。驯化的方法驯化的方法:炼苗由培养室转移到半遮荫的自然光下锻炼，在自然光下恢复植物体内叶绿体的光合作用能力和健壮度打开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向有菌，这样幼苗周围的环境就会逐步与自然环境相似。试管苗的驯化试管苗的驯化（三）、试管苗的移栽（三）、试管苗的移栽 常规移栽法常规移栽法 直接移栽法直接移栽法 嫁接移栽法嫁接移栽法 指选取生长良好的同一植物的实生苗或幼苗指选取生长良好的同一植物的实生苗或幼苗作砧木，用试管苗作接穗进行嫁接的方法。作砧木，用试管苗作接穗进行嫁接的方法。（四）、提高试管苗移栽成活率的途径（四）、提高试管苗移栽成活率的途径 试管苗的生理状况 植物生长调节物质 无机盐浓度 活性炭 环境因子 移栽过程中试管苗从无菌向有菌逐渐过渡 1进行植物组织培养需要哪些设备？各有何作用?2植物组织培养主要包括哪些环节?各环节的主要工 作内容是什么?3培养基包括哪些基本成分?其作用是什么?如何配制?4如何对外植体、培养基、培养器皿、接种器械进 行灭菌？5离体培养的植物材料对光、温、湿度有何要求？如何调控？6.何谓玻璃化？何谓褐化？如何克服？复复 习习 思思 考考 题题第二节第二节 实验室的设计与设备实验室的设计与设备 一、实验室设计一、实验室设计准备间、缓冲室、接种室、培养间准备间、缓冲室、接种室、培养间驯化室、温室驯化室、温室 准备室准备室高压灭菌器电子天平（0.0001g，0.01g）酸度计1.紫外线灭菌灯 2.日光灯 3.工作台 4.凳子 5.搁物架 6.窗 7.推拉门 8.缓冲间培养间二、设备、仪器二、设备、仪器超净工作台（一）设备 光照培养箱烘箱 摇 床体式显微镜倒置显微镜冷光源 电磁搅拌器摇床 空调机 除湿机 冰 箱电热蒸馏水发生器（二）各类器皿 1器皿的类型（1）培养器皿三角瓶、培养瓶、圆形培养瓶、果酱瓶、试管、L形管和T形管（2）分注器（3）刻度移液管（4）微量移液器（5）细菌过滤器（三）器械用具 打孔器 镊子 解剖刀 接种针 剪刀 电热灭菌器