PFG克隆及表达

绿色荧光蛋白的基因克隆及表达姓名：吴欣竹林小芳专业：生物技术（生物制药）学号：12110904010 12110904021目录1. 摘要32. 引言33. 相关背景44. 实验原理55. 实验材料及试剂76. 实验流程87. 实验时间安排101摘要目的：研究绿色荧光蛋白(green?fluorescent?protein, GFP)基因在大肠杆中的基因克隆与 重组表达。方法:通过对目的基因的提取，合适质粒的选取，构建基因工程所需的重组体，利用基因工 程的方法，PCR技术，大量克隆目的基因，最后利用合适的技术又到基因表达，对产物检 测后，确定目的基因是否达到克隆目的。关键词：绿色荧光蛋白大肠杆菌基因工程PCR技术2引言绿色萤光蛋白(green?fluorescent?protein),简称GFP,是一类存在于包括水母、水螅和珊 瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP?发射绿色荧光。这种 蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea?victoria的水母中发现。后来， 美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理，并对它进行了大刀阔斧的化学改 造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白 真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学家们选用。目前生物实验室普遍使用的荧光蛋 白，大部分是钱永健改造的变种。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下， 会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白 质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。？在生物学研究中，科学家们常常利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记。 将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。 生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出 来”。而且在一些方面，如分子标记、药物筛选、融合抗体、生物传感器等方面。除此之外, 绿色荧光蛋白在很多的领域存在着巨大的前景。本实验拟从含有GFP基因的生物中提取GFP基因，并在工程菌中克隆出该基因。3相关背景绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)GFP研究背景绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当 受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。日本科学家下村修1962年第一次从一种水母 中发现了绿色荧光蛋白。这种蛋白在紫外线光中呈现绿色，这种水母体内含有一种生物发光蛋白质equorin,但它本身发蓝光，通过对光谱的研究,下村修提出了发光景水母所发的绿光是因激发的水母 素向绿色荧光蛋白发生的荧光能量转移所致。即水母素作为一种能量供体，而绿色荧光蛋白 成为能量受体。水母素和绿色荧光蛋白都有重要的应用，但水母素是荧光酶的一种，它需要有 荧光素底物，经过酶促反应后发光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的 时候我们实际看到的颜色。其在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下呈现强烈绿色2。 1987年，道格拉斯普莱沙(Douglas Prasher)克隆出了 GFP的基因序列。1993年，在普莱 沙的基础上，马丁沙尔菲(Martin Chalfie)成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的 其他生物(如大肠杆菌等)也能产生GFP,这不仅证实了 GFP与活体生物的相容性，还建 立了利用GFP研究基因表达的基本方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。 至此，生物医学研究的一场“绿色革命”揭开了序幕。此后，谢尔盖路基亚诺夫(Sergey A. Lukyanov)又从一种珊瑚中分离出了与绿荧光蛋 白类似，但能发出红色光的荧光蛋白，预示着荧光蛋白可以有不同的颜色。美籍华人钱永健 (Roger Y. Tsien)系统地研究了绿荧光蛋白的工作原理，。钱永健还对绿色荧光蛋白进行了 颜色突变。不同颜色可以同时在同一个细胞或组织内标记多种蛋白或结构。多种颜色的绿色 荧光蛋白的出现,为研究蛋白之间的相互作用、蛋白分解等提供了无限的可能性。现在世界 各地实验室使用的GFP ,都是经过改造优化了的，而钱永健是这方面的先驱和领先人物2。 1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二长420 nm， 宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平行B折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋 开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很 重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环 化和氧化形成。2001年1月11日，美国科学家宣布培育成世界上首只转基因猴,这是世界上首次培育 成功转基因灵长类动物添加在这只名为安迪的猴子体内的就是这种标志基因。4实验原理4.1目的基因的分离及运载体的选择4.1.1目的基因的分离目的基因是指待测或待研究的靶基因，在分子克隆中，通常需要将这些基因从细胞中分 离出来，在体外或体内进行一系列的研究。目的基因通常可以通过多种途径来实现分离，如 从基因组内直接分离，人工合成，从基因文库内提取，PCR扩增等方式来实现。4.1.2质粒的分离和纯化质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。质 粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染 色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法转化进 细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药 基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新 表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。4.1.3 PCR 技术单菌落或提取的质粒DNA也可以通过PCR方法鉴定正确克隆。聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型 的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反 应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的DNA置于高温下使之解链， 人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；DNA 聚合酶在72C将单核苷酸从引物的3端开始掺入，沿模板从5 -3方向延伸，合成DNA 的新互补链。具体地说，PCR反应系统有寡核苷酸引物，反应缓冲液，热稳定DNA聚合酶（Taq酶）， 脱氧核苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分组成，缺一不可。PCR技术能在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的某一特定的目的DNA片段 扩增106倍以上，而无需经过烦琐的基因克隆程序便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。4.2酶切及连接II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamHI和Not I这样在识别序列 中进行切割的酶。成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别 的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连 续的序列（如 EcoR I 识别 GAATTC； Hind III 识别 AAGCTT;BamHI 识别 G I GATCC; Not I 识别GC I GGCCGC）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I识别GCCNNNNNGGC）。限 制性内切酶酶切DNA后形成两种类型的末端：（i）两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末 端，如EcoR I酶切后产生末端；（ii）两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心，产生平末 端。DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链 的3-末端具有一个游离的羟基（-OH）,和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基 团（-P）。4.3细菌感受态细胞的制备及转化大肠杆菌转化试验的技术关键就是制备感受态细胞，即应用一些特殊的方法（如电 击法，CaC12、RbCl （KC1）化学试剂法）处理后，使细菌细胞膜通透性发生暂时性的改变, 处于能允许外源DNA分子进入的状态，即为感受态细胞。CaCl2转化法的基本原理是细菌在低温、低渗（0C, O.lmol/L CaCl2）的溶液中，菌体细胞 膨胀成球形，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，外来的DNA可形成抗DNase的羟基-钙磷酸 复合物黏附于细胞表面，经42C短暂热冲击处理，促进DNA复合物进入细胞，从而实现外 源基因的转化。4.4重组体的筛选和鉴定由于实验中基因的转移方法的效率不高，真正摄入的重组DNA的受体不多，因此需要 从中筛选出含有重组DNA的细胞，并鉴定其正确性和基因表达的情况。重组质粒DNA是利用限制性内切酶（如BamH I和Not I）分别酶切基因片段和质粒后，利 用基因片段和质粒DNA 一端带有相同的粘性末端连接起来的重组质粒，如果再利用相同的 限制性内切酶识别重组基因片段两侧的酶切位点，通过酶切下的重组片段的大小与连接的基 因片段大小是否相同判断质粒DNA是否为重组质粒4.5 GFP基因的诱导表达IPTG （异丙基硫代0-L半乳糖苷）是一种常见的诱导基因表达的诱导剂，结构类似乳 糖。GFP基因连接到pET-28a的多克隆位点（MCS），GFP基因的表达受其上游T7启动子 和操纵基因O位点以及结合到这些顺式作用元件的蛋白因子的控制。LacI基因编码调节蛋 白,可以四聚体的形式结合到操纵基因O位点上，关闭GFP基因的表达o IPTG可与四聚体 调节蛋白结合，从而改变调节蛋白的构象，使调节蛋白不再与O位点结合。接着BL21编码 的T7 RNA聚合酶结合到T7启动子位点，从而启动GFP基因的表达。5实验材料及试剂5.1试剂灭菌的去离子水，PMD18-T（运载体），pEGFP-Nl （目的基因），EcoR I, Hind III, DH5a （克 隆菌），buffer K, BL21, Xho I（10U/p L） , T4DNA连接酶缓冲液，琼脂，氯化镁，Taq酶, T4连接酶，氯化钙，卡那霉素，X-Gal, Amp （100 mg/ml）, IPTG试剂的配制LB培养基的配制LB培养基的配制组成液体固体蛋白胨（Trypton）10g10g酵母提取物（YeastExtract)5g5gNaCl10g10g琼脂（Agar）15g蒸馏水定容至1000ml定容至1000mlT4DNA 连接酶缓冲液：50mmol/L KCL； 1025mmol Tris-HCL （pH8.49.0） ;1.5mmol/L 氯 化镁；明胶。5.2实验仪器：5.2.1质粒DNA的提取BIOEASY质粒小提试剂盒，微量移液器，离心机，紫外分光光度计5.2.2 PCR 扩增PCR扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管、5.2.3 DNA的连接与转化移液枪，微量离心管，水浴锅，振荡器，琼脂平板培养基，牙签5.2.4酶切反应与凝胶电泳微量移液器、离心机、恒温水浴箱、紫外检测仪、电泳仪、水平电泳槽6实验流程6.1质粒DNA的提取6.1.1 DNA 提取1.取1.5ml培养物加入Eppendorf管中，室温离心12000rpmX 1min,弃上清，将离心管倒置, 使液体尽可能流尽。2加入250p l溶液S1中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。3. 加入250p l裂解液S2,颠倒46次混匀（不要剧烈振荡），室温静置3min（不超过5min）。4. 加入350p l中和液S3，立即温和颠倒68次混匀，至出现白色絮状沉淀。5. 室温 12000rpm 离心 10min。6. 分次小心取上清液转至吸附柱中（带收集管），每次600p l,室温12000rpm离心30s，弃 滤液，将吸附柱重新放回收集管中。7. 向吸附柱中加入600p l洗涤液W, 12000rpm离心30s，弃滤液。&重复步骤7 一次。9, 空柱 10000rpm 离心 2min。10, 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50p l 56 预热的洗脱液， 室温放置1min, 12000rpm离心1min,收集洗脱液（即纯化的质粒DNA）, -20C保存备用。6.1.2质粒DNA定量测定1,取2 l提取的质粒DNA，加入98 l蒸馏水2,混合均匀3,用紫外分光光度计测定A260 6.2 PCR扩增6.2.1 PCR反应体系的设置（1）预混合液（Premix）的配置 试剂容量TaKaRa Taq1.25U/25uldNTP Mixture2*conc;各 0.4mMPCR Buffer2*conc； 3mM Mg 2保存温度：-20 C.（2）准备PCR反应溶液试剂容量Premix Taq25ul模板*0.1ul引物 1 (10uM)2ul引物 2 (10uM)2ul灭菌蒸馏水6.2.2 PCR仪上操作20.9ul（1）参数设置PCR的反应条件:3 Step PCR94 C30s30 cycles50 C 或 60 C30s30 cycles72 C60s30 cycles2 Step PCR98 C10s30 cycles68 C1 min/ kbp *30 cycles（2）预热：先不将PCR管插入模板，启动反应程序启动反应程序：待温度升至94C，按下“Pause”键，暂停反应程序，迅速将PCR管插 入模块，盖上盖子，再启动反应程序6.3 DNA的连接与转化1）在微量离心管中配置下列DNA溶液，全量为5p l2）pMDTM18-T Vector1|J lInsert DNA0.1 pmol - 0.3 pmoldH2Oup to 5 J l2）加入 5j l （等量）的 Solution I。3）16C反应30分钟。注）室温（25 C ）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 长片段PCR产物（2kbp以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至 数小时。4）全量（10j l）加入至100J l DH5a感受态细胞中，冰中放置30分钟。5）42C加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。6）加入800J l LB培养基，37C振荡培养60分钟。7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色 菌落。8）用牙签挑选白色菌落，在LB培养基上进行扩大培养（16C保存，过夜）。9）重复实验 一，提取 pMDTM18-T Vector 质粒。10）加入限制性内切酶EcoR I、Hind III获得含有目的基因的碱基片段，进入下一实验 凝胶电泳。6.4酶切反应与凝胶电泳6.4.1质粒DNA的酶切分析操作1. 在一个洁净的0.5 ml离心管中混匀下列反应物：反应物体积（卩l）10 X M酶切缓冲液2质粒 DNA5001000ng （10 pl）（根据具体实验结果确定）Hind III1EcoR I1H2O至202. 混合后37 C水浴12h 6.4.2琼脂糖凝胶电泳6.4.2琼脂糖凝胶电泳1.凝胶准备 称1g琼脂糖置三角瓶中，加0.5XTBE 100ml ； 微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖；2. 胶床准备 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙； 将胶床放在调整好的水平台上；3. 铺胶：将冷却至60C的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm；4. 室温下静置凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极；5.向 电泳槽中加入0.5 XTBE电泳缓冲液,越过凝胶表面即可；6.轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；7. 样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀；(上样缓冲液：EDTA；甘油，增大溶液密度；溴酚蓝，指示剂；二甲苯胺蓝，指示剂;)8. 上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为6卩1 ； 每组上2个样品1： DNA Marker ( 5 l )2：质粒DNA酶切产物(10 l )9. 盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；10.电泳条件：电压80v；时间2530分钟；11.电 泳结束后，切断电源，取出凝胶。12电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带13.取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察结果，并拍照记录。7实验时间安排第1天：接种含EGFP, pET-28a,质粒的菌培养过夜培养第 2 天：提取 EGFP，pET-28aPCR扩增EGFP片段，酶切pET-28a质粒 切胶回收两个片段，用T4 DNA连接酶连接过夜第3天：将连接后的质粒转化DH5 a感受态细菌中第4天：筛选阳性克隆，从而得到含pET-28a-GFP质粒的菌株第5天：提取pET-28a-GFP质粒再将其转入BL-21表达型菌株内，培养过夜第6天：将表达菌液扩大培养IPTG诱导，收集菌体参考文献1黄志军，周才学，王萍等。质粒DNA提纯方法的研究中华医药杂志2007年7月3号 2杨涛，程牛亮等。重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达中国生物工程杂志2004 年第4期3.齐志广，赵宝存，马闻师等。碱裂解法提取质粒DNA的研究。生物技术通报2003年 第六期4段子渊.PCR技术及影响扩增大片段基因产量的因素.草食家畜.1997.045钮晓音，李小彦，陈广浩绿色荧光蛋白标记的GRP78蛋白表达和功能研究南通医学院 学报2009.046萨姆布鲁克J，弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T,分子克隆实验指南M，金秋雁，黎孟枫，译.2 版.北京：科学出版，19957.吕素芳，刘铮，郭广君，蔡永萍，邱德文大肠杆菌中表达外源基因的方法