第三章-载体与宿主的选择ppt课件

第三章第三章 基因工程载体及宿主基因工程载体及宿主第一节第一节 用于基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征真核细胞的克隆载体1 载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记 具有较高的外源DNA的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 2 质粒2.1 质粒的定义质粒（质粒（Plasmid）：细菌细胞内一种自我复制的环状双链）：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。技术中重要的工具。双螺旋共价闭合双螺旋共价闭合环（环（SC构型）构型）开环双螺旋开环双螺旋（OC构型）构型）线状双螺旋线状双螺旋（L构型）构型）大肠杆菌的质粒主要有大肠杆菌的质粒主要有F质粒（大肠杆菌致育因子）质粒（大肠杆菌致育因子）、Col质粒（大肠杆菌素因子）、质粒（大肠杆菌素因子）、R质粒（抗药性因质粒（抗药性因子）、降解质粒等。子）、降解质粒等。隐蔽性质粒隐蔽性质粒多表型质粒多表型质粒2.2 质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒广泛存在于细菌细胞中，在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒。绝大多数的质粒是DNA型的，少量线型或RNA质粒。绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA（covalently closed circular DNA）质粒DNA的分子量范围：1-300 kb2.2.1质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒 1-3 拷贝 （stringent plasmid）松弛型复制控制的质粒 10-60 拷贝 （relaxed plasmid）不同类型质粒其本质是是否受宿主细胞不稳定的复制起始蛋白不同类型质粒其本质是是否受宿主细胞不稳定的复制起始蛋白控制。控制。即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。环境也可能有很大的变化。目前公认的用于阐释质粒用于阐释质粒DNA复制控制机理的分子模型有两复制控制机理的分子模型有两种：其一是种：其一是自体阻遏蛋白质模型自体阻遏蛋白质模型（autorepressor model），其二），其二是是抑制蛋白质稀释模型抑制蛋白质稀释模型（inhibitor dilution model）。前者的核心）。前者的核心内容是，阻遏蛋白质的合成受负反馈（内容是，阻遏蛋白质的合成受负反馈（negative feedback）机理）机理调节，而且其浓度是恒定的。后者的关键论点是，阻遏蛋白质是调节，而且其浓度是恒定的。后者的关键论点是，阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。（1）抑制蛋白质稀释模型）抑制蛋白质稀释模型它认为质粒它认为质粒DNA的复的复制，是受一种由质粒制，是受一种由质粒DNA编码的抑制蛋白质编码的抑制蛋白质Cop调控调控的。细胞中的。细胞中Cop蛋白质的浓蛋白质的浓度是同质粒分子的拷贝数度是同质粒分子的拷贝数成正比，它抑制质粒成正比，它抑制质粒DNA复制活性的作用方式有两复制活性的作用方式有两种途径：一种是通过同质种途径：一种是通过同质粒粒DNA的复制起点（的复制起点（oir）结合，直接地抑制质粒结合，直接地抑制质粒DNA的复制；另一种是通的复制；另一种是通过阻断起始蛋白质过阻断起始蛋白质Rep的合的合成，间接地抑制质粒成，间接地抑制质粒DNA的合成。的合成。（2）自体阻遏蛋白质模型）自体阻遏蛋白质模型在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后，L.Sompayrac和和O.Maaloe也提出了另外一也提出了另外一种解释质粒种解释质粒DNA复制机理的自体阻遏蛋白复制机理的自体阻遏蛋白质模型。质模型。这个模型对质粒这个模型对质粒DNA复制控制机理有复制控制机理有两种解释：两种解释：1.质粒质粒DNA的复制是由一种叫做起始蛋的复制是由一种叫做起始蛋白质白质Rep引发的。引发的。Rep蛋白质编码基因蛋白质编码基因rep和和自体阻遏蛋白质编码基因自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个是属于同一个操纵子，它们共转录成同一个操纵子，它们共转录成同一个mRNA分子。分子。自体阻遏蛋白质通过同启劝子自体阻遏蛋白质通过同启劝子-操纵基因区操纵基因区（P/O）的结合作用，调节质粒）的结合作用，调节质粒DNA的转录的转录作用，以维持细胞中作用，以维持细胞中Arr和和Rep蛋白质处于蛋白质处于恒定的水平。而后，由恒定的水平。而后，由Atr蛋白质调节产生蛋白质调节产生的的Rep蛋白质，则是通过同复制起点（蛋白质，则是通过同复制起点（ori）的结合，来引发质粒的结合，来引发质粒DNA的复制的复制图（图（a）。2.Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质。它既具有自体阻遏蛋白质的功能，可白质。它既具有自体阻遏蛋白质的功能，可同同P/O区结合而抑制转录作用；同时又具有区结合而抑制转录作用；同时又具有起始蛋白质的功能，能对复制起点（起始蛋白质的功能，能对复制起点（ori）发生作用，引发质粒发生作用，引发质粒DNA进行复制进行复制图（图（b）2.2.2 质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。2.2.3 质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定.接合型质粒接合型质粒分子量大分子量大严紧型复制严紧型复制 非接合型质粒非接合型质粒分子量小分子量小松弛型复制松弛型复制 在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关性。现归纳如下：定的相关性。现归纳如下：2.2.4 携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义2.3 质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法 质粒DNA纯度底、快速、操作简便沸水浴法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs碱溶法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNA cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA碱变性法质粒提取的原理：根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在pH值12.012.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。沸水浴法：用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA2.4 质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 TcrColE1 6.5 kb 拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr载体改造和构建的原则载体改造和构建的原则去掉不必要的DNA区段。减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。加入易于捡出的选择性标记基因。对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。改造或增加基因表达的调控序列。2.5 质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选2.6 重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr2.6.1 pBR322质粒载体 氯霉素可扩增拷贝数 50-100/cell用于基因克隆 P49-53pSC101pSE2124pMB1重要的大肠杆菌质粒载体2.6.2 pUC18/19 拷贝数 2000-3000/cell用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIIIP53-54重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：正选择标记 lacZ 的显色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galIPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被-半乳糖苷酶降解）重要的大肠杆菌质粒载体2.6.3 pGEM-3Z多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3ZPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等P55-56穿梭质粒载体：人工构建的具有穿梭质粒载体：人工构建的具有2种不同复制起点和选择标记，在种不同复制起点和选择标记，在2种寄主内都能存活和复制，并可携带外源基因往返穿梭的质粒载体种寄主内都能存活和复制，并可携带外源基因往返穿梭的质粒载体大肠杆菌大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体枯草杆菌穿梭质粒载体 如如pBE2 大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体酿酒酵母穿梭质粒载体 如如 pPIC9K 大肠杆菌大肠杆菌-动物细胞穿梭质粒载体动物细胞穿梭质粒载体 如如 pMT2 p562.6.4 穿梭质粒载体穿梭质粒载体大肠杆菌大肠杆菌-植物细胞穿梭质粒载体植物细胞穿梭质粒载体 如如 Ti 质粒质粒 3 噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增3.1 大肠杆菌的 l 噬菌体3.1.1 l 噬菌体的生物学特性：生物结构l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因l 噬菌体生物学特性：生物结构5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l l-DNAl 噬菌体生物学特性：感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解l 噬菌体生物学特性：感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75-105%即 36-51 kbDAl 噬菌体生物学特性：溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶原状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态3.1.2 l-DNA载体的构建：野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：插入型载体取代型载体DNA大小是野生噬菌体的大小是野生噬菌体的75-105%(37-51kb)，才能被包装成，才能被包装成噬菌体噬菌体（1）缩短长度）缩短长度l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度 37 kb插入片段大小：0-14 kb（51 37）l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度 10 kb（36 51）载体长度 26 kb插入片段最大装载长度 25 kb（2）删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点（3）加装选择标记与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记加装选择标记 imm434 imm434基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑加装选择标记 lacZ lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑构建琥珀密码子的突变体 琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株 3.1.3 l-DNA载体的主要类型：插入灭活型载体Charon2、Charon6、lgt11取代型载体lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正选择型载体lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），这种生长抑制表型受l-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑3.1.4 l-DNA重组分子的体外包装l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的3.1.5 l-DNA及其重组分子的分离纯化将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒 密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放l-DNA 乙醇或异丙醇沉淀l-DNA 3.1.6 l-DNA作为载体的优点l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达 外源基因3.2 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13噬菌体的生物学特性：生物结构M13噬菌体的外型呈丝状M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 DNA全长6407个核苷酸M13 DNA上至少有10个基因2700个外壳蛋白分子M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13噬菌体的生物学特性：感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13 DNA载体的构建：III VI I IV II X V VII IX VIII野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列载体lacZpolylinker大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13 DNA载体的特点：使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在DNA定向突变中非常有用M13重组分子筛选简便被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病毒基因组DNA。动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：单链DNA病毒双链DNA病毒单链RNA病毒双链RNA病毒 RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。4 考斯质粒与噬菌粒 l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。4.1 考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的含有l-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体1978年Collins和Hohn发明构建pHC796400 bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalIcos site-carrying plasmid1.8 kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45 kb考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解受体细胞4.2 噬菌粒（phagemid or phasmid）噬菌粒载体的特点：噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒载体：pUC118/119pUC118 pUC18+M13间隔区 IGpUC119 pUC19+M13间隔区 IG500 个拷贝3200 bpMCSlacZlacIoriAprM13-IGpUC118/119表示M13辅助噬菌体DNA噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT72958 bpMCSlacZPT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录提取出来的单链DNA重组分子在噬菌体RNA聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录5 人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（YAC）5.1 细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300 kb之间各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（gene cluster）结构构建动植物基因文库oriS,repE-F for plasmid replication and regulation of copy number.parA and parB for partitioning F plasmid DNA to daughter cells during division and ensures stable maintenance of the BAC.A selectable markers for antibiotic resistance,some BACs also have lacZ at the cloning site for blue/white selection.T7&Sp6 phage promoters for transcription of inserted genes.5.2 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）YAC载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的复制子 酵母染色体的着丝粒序列 酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为350-400 kb酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）酵母人造染色体的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI连接转化酵母菌重组酵母染色体插入大小质粒载体0-3k噬菌体载体0-10k或10-25kM13噬菌体载体1.5k粘粒载体20-45k人工染色体50-400kn6 真核细胞的克隆载体6.1 酵母细胞中基因克隆常用载体酵母细胞中基因克隆常用载体（1）能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基）能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增；因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增；（2）含有在酵母中便于选择的遗传标记。有些还携带用于大肠杆菌的）含有在酵母中便于选择的遗传标记。有些还携带用于大肠杆菌的抗菌素抗性标记；抗菌素抗性标记；（3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。共有三种类型）含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。共有三种类型的载体的载体 1.整合型载体（整合型载体（YIP）2.复制型载体（复制型载体（YRP）3.附加体型载体（附加体型载体（YEP）YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。如片段构成的。如Pyeleu10是由是由ColEI质粒和酵母质粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段构成，在细菌中复制、扩增，进入酵母后可整合）片段构成，在细菌中复制、扩增，进入酵母后可整合表达。表达。YIP型载体的特点是转化率低型载体的特点是转化率低(只有只有1-10转化子转化子/微克微克DNA)，但转化子遗传性稳定稳定，多用于遗传分析工作。，但转化子遗传性稳定稳定，多用于遗传分析工作。YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的型载体是带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制杆菌质粒中构成的。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种截然不同的基因，所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体（生物细胞中复制的载体称为穿梭载体（Shuttle Vector）.穿梭载穿梭载体在基因工程中广泛使用。体在基因工程中广泛使用。YRP型载体转化率高，拷贝也高，型载体转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失但不稳定，易丢失YEP型载体型载体一般由大肠杆菌质粒、2m质粒以及酵母染色体的选择标记构成。2m质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2m质粒，人们已经构建出许多YEP型载体。YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105转化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也高（25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。6.2 植物基因克隆的载体植物基因克隆的载体Ti质粒质粒Ti质粒存在于能够引起质粒存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中。这土壤农杆菌中。这种肿瘤的形成是由种肿瘤的形成是由Ti质粒决定的，故质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质称为诱导肿瘤的质粒（粒（Tumor inducing plasmid），简称，简称Ti质粒。质粒。T-DNA的染色体整合机制的染色体整合机制农杆菌介导法农杆菌介导法大肠杆菌质粒大肠杆菌筛选标记农杆菌筛选标记多克隆位点重组质粒转化大肠杆菌农杆菌细菌接合T-DNA区同源整合农杆菌感染植物根部细胞T-DNA区整合在植物细胞基因组上共整合转化程序共整合转化程序LBRBT-DNA外源基因植物细胞筛选标记 Kmr大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒大肠杆菌筛选标记农杆菌筛选标记农杆菌ori大肠杆菌ori二元整合转化程序二元整合转化程序6.3 SV40病毒（猿猴空泡病毒病毒（猿猴空泡病毒40）呈小型）呈小型20面体，环状面体，环状DNA，外壳蛋，外壳蛋白由白由VP1、VP2、VP3构成。构成。受纳细胞（受纳细胞（permissive cell）：能使细胞裂解释放感染性病毒颗粒）：能使细胞裂解释放感染性病毒颗粒，并使寄主细胞裂解，如猿猴细胞，并使寄主细胞裂解，如猿猴细胞 。非受纳细胞（非受纳细胞（non permissive cell）：不产生感染性病毒颗粒，但）：不产生感染性病毒颗粒，但能整合到细胞染色体中产生癌变，如小鼠或仓鼠的细胞能整合到细胞染色体中产生癌变，如小鼠或仓鼠的细胞。SV40病毒载体病毒载体 1.取代型重组病毒载体取代型重组病毒载体2.重组的病毒重组的病毒-质粒载体质粒载体取代型的重组病毒载体取代型的重组病毒载体（recombinant Virus Vector）,其特其特点是外源点是外源DNA直接插入在缺陷型的病毒基因组上。插入直接插入在缺陷型的病毒基因组上。插入的外源的外源DNA片段在大小同被取代的病毒基因组区段是等片段在大小同被取代的病毒基因组区段是等同的，这样形成的重组体同的，这样形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。但为了补充被取代的胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。但为了补充被取代的病毒基因组病毒基因组DNA的功能，必须使用一种与之互补的辅助的功能，必须使用一种与之互补的辅助病毒。病毒。晚期区段取代载体晚期区段取代载体 早期区段取代载体早期区段取代载体只取病毒基因组中维持在辅乳动物中进行复制的有关序列，使只取病毒基因组中维持在辅乳动物中进行复制的有关序列，使它与一个细菌质粒融合。它与一个细菌质粒融合。含有完整早期区段的复制起点的病毒含有完整早期区段的复制起点的病毒-质粒载体（如质粒载体（如Pac10）：它是由病毒的早期区段和复制点同大肠杆菌的）：它是由病毒的早期区段和复制点同大肠杆菌的质粒分子重组而成。由于既能在大肠杆菌中复制，又能质粒分子重组而成。由于既能在大肠杆菌中复制，又能在哺乳动物细胞中复制，所以也称为穿梭载体。在哺乳动物细胞中复制，所以也称为穿梭载体。微型病毒复制子微型病毒复制子-质粒载体：只是把质粒载体：只是把SV40复制起点片段复制起点片段插入到大肠杆菌质粒载体上，可用于特殊细胞系来克隆插入到大肠杆菌质粒载体上，可用于特殊细胞系来克隆和表达比如前面讲的和表达比如前面讲的COS细胞细胞。第二节 用于基因转移的受体菌或细胞各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 各种基因工程受体的特性大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定 适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌 产结构复杂、种类繁多的内毒素用于接受质粒的大肠杆菌菌株：DH5、C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA的大肠杆菌菌株：LE392、ED8654 各种基因工程受体的特性枯草杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备各种基因工程受体的特性链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢各种基因工程受体的特性酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌 内源性蛋白产物种类繁多且含量高代表菌株：毕赤酵母、啤酒酵母各种基因工程受体的特性昆虫细胞（家蚕）具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定 适用于真核生物基因的高效表达 DNA重组操作系统欠完善各种基因工程受体的特性哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体 细胞培养条件苛刻，生长缓慢 各种基因工程受体的特性植物细胞（拟南芥菜、烟叶）农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良 遗传操作繁琐