细胞色素C幻灯片

2021/8/51细胞色素细胞色素CC小组成员：潘炯琛、吕武燕、汪晨蕴、臧月梅、蔡晨、郦元 2021/8/52 细胞色素细胞色素C C：包括多种能够传递电子的含铁蛋白质的总称。它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中。细胞色素C是呼吸链中极重要的电子传递体。它主要存在于线粒体中，需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中，细胞色素C含量丰富。2021/8/53理化性质细胞色素细胞色素C：l分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高，为碱性蛋白。l等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。l易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。2021/8/54理化性质 细胞色素细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热，酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起部分失活。细胞色素C粗品是还原型和氧化型两种产品的混合物,在测定含量时,要加入联二亚硫酸钠,使混合物中的氧化型转变为还原型，还原型细胞色素C水溶液在波长520nm 处有最大吸收值。2021/8/55临床应用 细胞色素细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。如：一氧化碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏疾病引起的缺氧等。2021/8/56基本原理 细胞色素细胞色素C是易溶于酸性溶液,故采用酸化水提取。人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5时细胞色素C 呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。装入层析柱后，用25%硫酸铵洗脱，可将细胞色素C 交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C 的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度，主要为去除杂蛋白。另外三氯乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量。2021/8/57单击此处添加标题 匀浆提取液新鲜猪心氨水、PH6、过滤滤液氨水PH7.2过滤人造沸石水、NaCl、硫酸铵洗脱液硫酸铵盐析滤液TCA沉淀、离心沉淀物蒸馏水细胞色素C粗品溶液硫酸、PH42021/8/58细胞色素细胞色素CC的制备和测定的制备和测定2021/8/59材料与试剂材料与试剂 新鲜（冷冻）猪心样品（新鲜（冷冻）猪心样品（200g200g）1mol/L H2SO4 1mol/L H2SO4：500mL500mL 1mol/L NH4OH1mol/L NH4OH：500mL500mL 12%BaCl212%BaCl2：250mL250mL 25%(NH4)2SO425%(NH4)2SO4：500mL500mL 0.2%NaCl0.2%NaCl：500mL500mL 20%20%三氯乙酸（三氯乙酸（TCATCA）：）：100mL100mL 人造沸石：白色颗粒，人造沸石：白色颗粒，40-60 40-60目目 联二亚硫酸钠联二亚硫酸钠 细胞色素细胞色素CC标准液（标准液（3mg/ml3mg/ml）2021/8/510仪器仪器绞肉机，电磁搅拌器，离心机，分光光度计，绞肉机，电磁搅拌器，离心机，分光光度计，烧杯（烧杯（1000ml，500ml，200ml，50ml各若干），各若干），量筒，移液管，玻璃漏斗，玻璃棒，量筒，移液管，玻璃漏斗，玻璃棒，纱布纱布，滤纸滤纸，容量瓶容量瓶，试管试管，离心管，离心管 2021/8/511步骤步骤步骤步骤1.猪心预处理与提取猪心预处理与提取2.中和中和3.吸附与洗脱吸附与洗脱4.盐析盐析5.TCA沉淀沉淀6.标准曲线的制备标准曲线的制备2021/8/5121.1.猪心预处理与提取猪心预处理与提取。1.新鲜或冷冻猪心，除尽脂肪、血管和韧带，洗新鲜或冷冻猪心，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小快，放入绞肉机中绞碎（两遍）。尽积血，切成小快，放入绞肉机中绞碎（两遍）。2.称取猪心碎肉称取猪心碎肉200克，加克，加蒸馏蒸馏水水300毫升毫升3.用电磁搅拌器搅拌提取，再用用电磁搅拌器搅拌提取，再用1mol/L的硫酸调的硫酸调PH=4.0，（需要不断调整）搅拌提取（需要不断调整）搅拌提取1.5小时。用小时。用1mol/L的氨水调的氨水调PH=6.0，停止搅拌。，停止搅拌。4.四层纱布挤压过滤，收集滤液。四层纱布挤压过滤，收集滤液。2021/8/5132.2.中和中和 用用1mol/L1mol/L的氨水调滤液的氨水调滤液PH=7.2-7.5PH=7.2-7.5，静置，静置20302030分钟，使沉淀沉下。分钟，使沉淀沉下。过滤除杂质，下部浑浊液离心（过滤除杂质，下部浑浊液离心（3000rpm,15min3000rpm,15min）。合并得到的红色清夜，测）。合并得到的红色清夜，测量体积。量体积。2021/8/5143.3.吸附与洗脱吸附与洗脱 吸附：吸附：加加1010人造沸石人造沸石磁力搅拌器搅拌吸附磁力搅拌器搅拌吸附1h1h蒸馏水洗蒸馏水洗3 3次次0.2%NaCI0.2%NaCI溶液洗溶液洗3 3次次蒸馏水洗蒸馏水洗3 3次次滤出人造沸石待用滤出人造沸石待用 洗脱：在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水洗脱：在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水将沸石放入柱中将沸石放入柱中装满装满25%25%硫酸铵溶液进硫酸铵溶液进行洗脱，流速控制在行洗脱，流速控制在2ml/min2ml/min以下以下,收集红色的收集红色的洗脱液洗脱液2021/8/5154.4.盐析盐析 为了进一步提纯细胞色素为了进一步提纯细胞色素CC，向洗脱液中缓慢加，向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵，入固体硫酸铵，（即即100ml100ml洗脱液加洗脱液加17g17g硫酸铵硫酸铵）边加边搅拌，放置）边加边搅拌，放置3030分钟分钟，杂蛋白沉淀析出，杂蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素过滤，收集红色透亮的细胞色素CC滤液，测量体滤液，测量体积。积。2021/8/5165.TCA5.TCA沉淀沉淀 按按8%8%体积滴加体积滴加TCATCA，边加边搅拌。此时细胞色素，边加边搅拌。此时细胞色素带正电荷，与其结合生成可逆沉淀析出，立即离带正电荷，与其结合生成可逆沉淀析出，立即离心（心（3000rpm3000rpm，15min15min）,收集沉淀（若上清液仍收集沉淀（若上清液仍为红色，倒出后再补加为红色，倒出后再补加5%5%体积的体积的TCATCA，再次离心，再次离心，收集沉淀）。沉淀用少量去离子水溶解（体积，收集沉淀）。沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过不超过10mL10mL）。）。2021/8/5176.6.标准曲线的制备标准曲线的制备以细胞色素以细胞色素C的浓度（的浓度（mg/ml）为横坐标，以吸光）为横坐标，以吸光度度A520nm为纵坐标制作标准曲线，按表绘制细胞为纵坐标制作标准曲线，按表绘制细胞色素色素C含量的标准曲线含量的标准曲线2021/8/518纯度检测纯度检测 因为细胞色素因为细胞色素CC属蛋白质，所以利用聚丙烯酰属蛋白质，所以利用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测所的样品分子量大小以及纯度胺凝胶电泳来检测所的样品分子量大小以及纯度，从而评价所的样品的质量。，从而评价所的样品的质量。具体操作：具体操作：预先配置聚丙烯酰胺凝胶，样品和标准品分别预先配置聚丙烯酰胺凝胶，样品和标准品分别混合缓冲液点样，再点上标准屏，在恒定电压作混合缓冲液点样，再点上标准屏，在恒定电压作用下，达到分离的目的。后用考马斯亮蓝染液对用下，达到分离的目的。后用考马斯亮蓝染液对蛋白质进行染色，后同脱色液脱去多余染液，得蛋白质进行染色，后同脱色液脱去多余染液，得到电泳图。到电泳图。2021/8/519部分资料从网络收集整理而来，供大家参考，感谢您的关注！