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地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH,冰冻切片操作过程：1、 多甲固定：应尽量在半个小时内完成。（固定时间以 24-36小时为宜，避免 RNA 降解或固定过度。）2、切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。（选用16um）（切好的片 子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在 4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。（重新固定 10-15min）3、用 0.1MPB 洗切片 3*5min4、切片放入100%乙醇5min,空气中干燥。杂交液：（ 20ml）藏于-20 度20*SSC 4ml硫酸葡聚糖 4g去离子甲酰胺 10ml 将他们溶解后，加入以下物质：Poly A（ 10mg/ml）0.5 mlSsDNA（ 10mg/ml）0.5 mltRNA （ 10mg/ml）0.5 mlDTT （1M）2ml50*Denhardts 0.2ml 上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到 37度。杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是 100ng-1000ng/ml， 一般是以 200ng/ml 为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定， 对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可能30-40ul足够。加好杂交液以后，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何的气泡），为防止杂交 液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的话杂交 会有一个很高的背景）在湿盒中 37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交的信号，但 是前提是不能让切片干燥。杂交后处理 ;制备0.5*SSC和1*SSC （从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用的时候的温度是 55 度。注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10mM的DTT （将1.2g的DTT加入到800ml的 SSC 中）杂交后，用小镊子将盖玻片轻轻移走，然后倒掉杂交液，将切片放入洗液中，在振摇 水浴 中按照下面的要求来洗片：快洗： 1*SSC（10mMDTT）室温2*15min： 1*SSC（10mMDTT） 55度2*15min 0.5*SSC（10mMDTT） 55度1*10min 0.5*SSC（ 10mMDTT）室温 将切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。检测：将切片转移到TBS缓冲液中（100mM tris-HCl, 150mM NaCl, PH=7.5），将切片在 TBS缓冲液中洗3*5min,封闭：（可选）将切片放在封闭液中放置30min （封闭液配方:TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血清 （sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche）,将切片拿出封闭液中，用地高辛抗体和切片在TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血 清（sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche）于室温下孵育至少4小时，然 后在TBS中洗3*5min，然后在去离子水洗涤几次以去除盐，最后用抗淬灭剂分片观 察原位杂交要做的对照;1、切片中mRNA的质量（前提是新鲜的组织样品）和protocol的有效性。 PolyT探针：如果PolyT探针杂交的信号很弱的话，说明切片的RNA已 经降解比较严重。2、杂交特异性对照：检测探针只是和RNA结合，用RNA酶处理后如果没有 杂交信号的，则说明杂交只是和RNA结合。（注意，RNA酶的处理应该在固定以后 用PBS洗两次*5min立即进行） 用正义和反义探针来杂交，如果用正义探针杂交得不到任何的信号，则 可以说明杂交的信号是特异性的杂交预处理：1、在37C恒温箱内干燥切片后，滴加5-10 口 g/ml蛋白酶K,置37C湿盒内孵育 30min，4C75%酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性。一般应用蛋白酶K 1卩g/ml（于0.1 mol/L Tris,50 mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中），37C孵育1520 min，以达到充分 的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂 交信号。甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂，常用0.1 mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用， 应用胃蛋白酶（Pepsin）20100 ug/m l（用 0.1 N HCl配）37C、30 min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。为保 持组织结构，通常用 4%多聚甲醛再固定。2、0.25% 醋酸酐 10min,经 70C 2XSSC 漂洗、40C 2XSSC 各漂洗 15min，2XSSC 3min,切片经75-100%酒精梯度脱水。1. 蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽的靶核酸，以增加探针的可结合性。蛋白酶K浓度过低，不能使靶 核酸有效暴露，浓度过高则组织消化过度，也会影响检测结果。蛋白酶 K 须用蛋白酶 K 缓冲液配制 （O.lmol/L Tris-HCl PH &0, 50mmol/L EDTA,经高压灭菌后备用），蛋白酶K应新鲜配制，低温冰箱 内分装保存。蛋白酶 K 消化组织切片是原位杂交实验流程中重要环节，蛋白酶 K 浓度应力求准确无 误。2. 根据组织类型、固定液的种类，固定时间和切片的厚薄的不同，蛋白酶K浓度也存在 差异，选用蛋白酶K最佳消化浓度是原位杂交成功的必要条件，不可省略 预杂交 预杂交液;去與子甲旺議500）终浓谨5050xSSC（4 SSPE）100屈* 或旬X “醐h印山上疲2$0mi5 x10% SDS50 inf0.5%变性錐鞘叫3 0%1 000 ini临用前加；预杂交液不加配制：先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50C促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室温 常需数小时才能完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。根据使用方便可分装(最好用铝箔将瓶子包好)存于 4C，可达数月。注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染1、将DEPC处理的切片经ddH20漂洗2X 5min2、按组织片大小，每张切片滴加40 口 1杂交液，置37C温盒内2小时杂交1、抖去甩干杂交溶液，用DAKO魔笔沿组织周围划圈，滴加30 口 1探针杂交液/每张切片(内含20ng地高辛标记的探针)，在某温度下(改温度为：TM-)湿盒内孵育过夜杂交液内加入变性剪切的鮭鱼精子DNA在杂交前加入，与其它杂交液分开储存。杂交液能在一20 C保存几个月杂父后处理1、将切片置37C 2XSSC中漂洗2X10min。2. 在 37C 2XSSC 漂洗 2X15min、1XSSC 漂洗 2X15min、0.25XSSC 漂洗 2X15min,均需用振荡 漂洗切片。最适复性温度(Opti munm rena turation t empera tu re, TOR)： Tor =Tm - 25C 苛刻复性温度：Ts = Tm - (10或15C) 非苛刻复性温度：Tns =Tm 一 (30或35C) 在2XSSC反应液中，可以根据下列公式计算最适复性温度：TOr =0.51 (G+C%)+47C 减低背景染色背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后(Posthybridization)的酶处理和杂交后的洗涤 均有助于减低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐(acetic anhydride)和三乙醇胺(t riethanolamine)中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了 背景染色。4 杂交后漂洗(1) 2XSSC液内振动移除盖片。(2) 2XSSC 55C 10 minX2。(3) 0 5XSSC 50C 5 minX2。(4) 缓冲液11(含05%封阻试剂，用缓冲液I溶解)37C 30 min。(5) 缓冲液 I (100 mmol/L Tris HCl,15 0 mmol/L NaCl pH7 5)15 min,室温。(6) 酶标地高辛抗体(1： 5 000，应用缓冲液I解释)37C 30 min。(7) 缓冲液I 15 minX2,室温。(8) 缓冲液 111(100 mmol/L Tris HCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl 2,pH95)室温，2 min。(2)杂交后漂洗其目的是去除未参与杂交体形成的过剩探针,消除与组织或细胞之间的非特异性结合的探针， 降低背景染色，增加信/噪比。将杂交玻片从湿盒(或杂交仪)中取出，用2XSSC将盖玻片洗脱,2XSSC 30C洗2次，每次15 min;1X SSC 42C洗2次，每次15 min;0 5XSSC 37C洗2次，每次15 min,TBS缓冲液洗2次。注意在漂洗 过程中切不要使切片干燥。(5)对照试验 阳性对照:用已知含靶核酸序列的组织作对照。 阴性对照:用已知不含待测靶核酸序列的组织作对照。 用免疫组化检测方法来确定杂交信号的分布。 省略标记探针。 DNA酶消化靶DNA对照。HJ1(6)非特异性染色非特异性染色可能会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等;探针特异性不高 以及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色。组 织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因，目前最常用的酶是过氧化物酶和 碱性磷酸酶，这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应 步骤。如过氧化物酶用3% H202处理510 min;10%冰醋酸处理组切片10 min,或在底物显色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。NBT/BCIP显示 碱性磷酸酶时如果在光照下显色也会增强非特异性染色。必须根据检测系统不同 的标记酶作不同的内源酶处理。2.探针的长度原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为 背景着色度高低与探针浓度有关。最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合 度为目的。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记cRNA探针的浓度为0.5ng/ul,而非 放射性标记cRNA探针的浓度1.0ng/ul。杂交液的量要适当，每张切片以30-50卩l为宜。保持杂交 液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。3杂交的温度和时间设置和调整杂交温度是RNA原位杂交的重要环节。杂交温度应低于解链或融解温度(melting temperature Tm)20-30C。多数RNA原位杂交Tm为95C，由于这一温度对保存组织形态完整和组织 切片的粘附将产生不利影响，为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度来降低Tm值，因为每增加1%甲 酰胺浓度可降低0.72C。另外杂交体中GC的百分比，杂交体长度以及杂交液中Na+的浓度也与Tm呈 正相关。杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过 长会增加非特异性着色。一般RNA原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以避 免光线对甲酰胺的电离作用。为利于mRNA检测，固定时间不要超过36小时，以免引起RNA与蛋白质之间发生交联。(三)预杂交(1)切片用 DEPC 处理的 PBS PH7.4(140mmol/L NaCl，2.7mmol KCl,10mmol/L Na2HP04, 1.8m mol/L KH2P04)孵育 2X5min，再用 DEPC 处理的含 100mmol/L 苷氨酸(Glycine)PBS 孵育切片 2X5min。(2)用 DEPC 处理的含 0.3% Tri ton X-100 PBS 孵育 15min。(3)用 DEPC 处理的 PBS 漂洗 2X 5min。(4)冰冻切片用 TE 缓冲液(100mmol/L Tris-HCl ,50 mmol/L EDTA PH &0)不含 RNA 酶的 lu g/ml蛋白酶K,在37C下通透切片30 min。石蜡切片用TE缓冲液配制的不含RNA酶的5-20 u g/ml 蛋白酶K,在37C下通透切片30min。(5)在4C下用DEPC处理的4%多聚甲醛PBS溶液作后固定 5min。(6)再用DEPC处理的PBS冲洗切片2X5min。(7)切片作酸酐处理，处理液含0.25醋酸酐、 0.1mol/L三乙醇胺(Triethanolamine TEA)PH8.0,振荡漂洗2X5min。(8)在37C 孵育切片后，杂交 缓冲液冲洗(含50%去离子甲酰胺的4XSSC),至少10 min。注意事项(1) 切片的通透化是RNA原位杂交关键步骤，特别对回顾性资料尤为重要，因固定液种类和固 定时间的不同，需作最佳通透化条件探索，包括蛋白酶K浓度，孵育时间20-30min之间调整 ，甚至采用0.2mol/L HCL配制的0.1%胃蛋白酶。(2) 由于醋酸酐极不稳定，宜将醋酸酐在使用前加到TEA缓冲液中。(3) 1 XSSC = 150mmol/L NaCl,15mmol/L sodium citrate pH7.2。(四)免疫荧光检测1. 滴加封闭缓冲液(100mmol/L Tris-HCl PH7.5、150mmol/L NaCl、2% BSA)置 37C 湿盒内30min，以封闭非特异性结合部位。2. 沥干细胞片，滴加抗地高辛抗体(1:200、1:500用封闭缓冲液配制)在37C内45 min。3. 用 Buffer A PH7.5(100mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、0.05% Tween 20)冲洗漂洗 各 5min。4. 由低浓度至高浓度(70%, 90%，100%)各级酒精梯度脱水各5min。5. 空气中干燥细胞片。6. 滴加甘油显色混合液。注意事项甘油显色混合液的配制：9份甘油比1份(1mol/L Tris-HCl(PH7.5), 2% 1.4-diaza-bicyclo -2.2.2-octane (DABCO)和 DNA 复染剂(或碘化丙啶 Propidium iodide PI 500ng/ml)或 DAP I (75ng/ml)7. 在荧光显微镜下观察。3预杂父和杂父(1) 加约30 ul预杂交液在每张载片上，室温孵育1 h。如加鲱鱼精子DNA，用前须在沸水浴中 加热变性10 min,酵母tRNA不用加热。(2) 预杂交后以2XSSC漂洗，以吸水纸试干切片周围水份，应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo 探针,浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前 促黑激素(proopiomelanocortin,P0MC)mRNA 的 Oligo 探针，其理想工作浓度为 342 ng/ml(0342 ng/ul)。加30 ul杂交液在切片上,加硅化盖玻片，在37C过夜。如探针大于36碱基则杂交温度为42C。次日室温2XSSC液漂洗切片1 ho(5)1XSSC漂洗切片1 h (室温)。0 5XSSC 37C漂洗半小时。(7) 05XSSC室温漂洗半小时。(8) 显示等方法同前述。Application DilutionCone. Sufficien1:5001:10000:2-0:4in situ hybridizati on2. Denhardt液通常配成10x, 50x或100x的储备液Wx50 xEOOx骤蔗摘（Fi叔1 400）21020耳聚乙烯毗错烷酮fpvR210哋弟血渭號蛋白（的Q21020f.灭茵或 DEPC 水）-1000 in配制：称取上述试剂，溶于800ml左右灭菌ddHQ中，定容至1000ml后，过滤后于-20C保存备用。该液用于配制杂交液及予杂交液等。1蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K）蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分 子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种 类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其 配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20C存放，用时再取出冻融，余者弃去。（2）工作液（临用前配）：方准一100fd4ml取储备液（1mg/ml）按1: 40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。_ f Pro, K S8 备液（ling/ml） 方法二：*I Pro.K缓冲疱lOOpl（3）关于P-K缓冲液的配制:O.lmol/L 畑-HCID .OSiiwIZL EDlAr hnol/l. Tri- HCi(pllS,0) 配制：Omot/L IOTAddlLOKimIO ml帥山称取上述试剂，充分混合即可。1mol/L 的 Tris-HCI(pH8.0)：TrisNdlKO12Mg_ I 000ml先将Tris于800ml ddH2O中溶解，用HCI将pH调至8.0,ddH2O定溶于1000ml,高压灭菌，室温备用即可。0.5mol/L 的 EDTA：EDTA186,lghldJLO I 000ml称取EDTA溶于约600ml ddH2O中，常需60C持续搅拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0时，EDTA才开始溶 解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH调pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml，高压灭菌，室温备用。2甘氨酸（1） 1mol/L 甘氨酸：甘氨酸.ddH2O（或 DEPC 水）75g“ I OOOml称取甘氨酸75g溶于ddH2O或DEPC水中，最后补足ddH2O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，- 20C储存。（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：Jrrwl/L甘氨酸LPBS100ml900ml将二者按1： 10比例稀释，即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配制。甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用，以防过度消化。3. 0.25%醋酸-0.25%醋酸酐试別r W HUA璋酸阳(临用幽诫1 3 .2irll5.g4, Ornl足容至丨OOOml约9S0nil)2.5ml配制：按上述配方，先以少许DEPC水溶解NaCI，然后加入三乙醇胺及浓HCI。DEPC水定容至约 1000ml(997.5ml),临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐，充分混合。注意操作时避免浓HCI溅出，最好在通风条件 下进行。生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片 标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。4. RNA酶溶液J RNA 酶 AICOnd100/J100ml1 DEPC 水取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分装成小份(1ml,10mg/ml)，-20C储存。M RNA SS A 储备液 lOmg/rnl) 工作液:(2 xSSC临用前，取RNA酶A储备液，用2xSSC溶解配成工作液(0.01mg/ml).5.0.2%Triton X - 1002 mlI PBS99蛊ml取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振荡使其充分混合。八、杂交后漂洗溶液无论用何种标记方法及何种信号显示方法，在杂交后洗脱则是大同小异。在此，归纳几种带有共同性及常用的洗 脱液。|2x5SC1 .IOObiJ10n)-1 lOOOmK定容戈端 Tinon X - 1(X)(或 0血 S&Sj SSL试剂： WiTiiw X- 100( 30%- ST)S)I畑為I该液常用于杂交后的初次洗脱，故离子强度(张力)较高。1 JO J x SSCb + l站Triinn X 印0（滅前霽5DS |20x SSC就如* 触 TriLois X -】加（或FO% SDS） 天摘 iklllJJ5 milOinl一 i oo如h（定容）该液常用于杂交后的第二次洗脱，离子强度较低，经过上述两套洗脱液洗后，有的还可用2xSSC, 10% (0.1%) SDS洗脱。f UNA 隘匕 X SSC1000-IQOmi主要是洗去残留的RNA,降低背景。用于以RNA为探针的原位杂交方法中。4. Dig标记探针杂交后处理液3ino/L缓冲菠 k SmoI/LNaGl B5A100ml0 -1 jnol/L20ml 0.1l/L2mwvil/t3匪孑 ,(常费.不能fn,叮省略)用ddH2O溶液并定容至1000ml。缓冲液2：fTSMj-1 mol/L Tris（pH7.5）5rnuJ/L aCI.I mol/L MCl2JOOnJ0 r 1 nioI/L20 ml0 . mol/I，50nJ50miuol/L用ddH2O溶解并定容至1000ml。鑲沖液 3 ； fl mol./L- rtt；（ jjH7.5 ） T*（终止液）i mol/L LDTA2（）1111 20rimcl/J5 ml 5mmol/L配制同上。
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