《共聚焦激光显微术》PPT课件

共聚焦激光扫描显微术共聚焦激光扫描显微术及其在生物医学中的应用及其在生物医学中的应用姚忠祥姚忠祥一、概述一、概述l共聚焦激光扫描显微术共聚焦激光扫描显微术(Confocal Laser Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)Scanning Microscopy,CLSM)l特点：特点：1 1.显微镜成像显微镜成像 2 2.激光扫描激光扫描 3 3.计算机图象处理计算机图象处理简史简史:马文马文.闵斯基闵斯基(Marvin Minsky)1957 Marvin Minsky)1957 （美国专利）（美国专利）矛矛 盾：成像质量、扫描速度盾：成像质量、扫描速度 狭缝扫描狭缝扫描:成像质量不佳成像质量不佳 台阶扫描台阶扫描:光栏不动，移动工作台标本光栏不动，移动工作台标本 光束扫描：现通用光束扫描：现通用二、基本原理二、基本原理1 1.光学成像光学成像l激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上l反射光或荧光经目镜汇聚于探测器反射光或荧光经目镜汇聚于探测器l探检测器前有一小孔探检测器前有一小孔(Pinhole)Pinhole)汇聚光束汇聚光束2 2.成像保存成像保存 以电信号形式储存，以电信号形式储存，可以进行图象分析（参数、可以进行图象分析（参数、伪彩、值等）。伪彩、值等）。3.3.共轭共轭(confocal)confocal)是指光源孔和检测针孔对是指光源孔和检测针孔对物镜焦平面是共轭的。物镜焦平面是共轭的。宽场照明显微镜和共聚焦图象比较宽场照明显微镜和共聚焦图象比较三、三、CLSMCLSM的应用的应用展现最清晰图象细节展现最清晰图象细节图象处理功能图象处理功能1 1.光学切片功能：显微光学切片功能：显微CTCTumum2 2.三维图象重建：三维图象重建：3 3D D软件软件 X X，Y Y，Z Z轴重建，立体旋转轴重建，立体旋转 3 3.荧光物质的定位，定量与动态测量（单标、荧光物质的定位，定量与动态测量（单标、双标、多重标记）双标、多重标记）高速采集高速采集DronpaDronpa蛋白蛋白FRAPFRAP光漂白光漂白Folu-EGFP-EB3Folu-EGFP-EB3TubulinTubulinActinActin线粒体线粒体4 4.细胞内细胞内PHPH及及Ca,NaCa,Na等离子定位、双标记等离子定位、双标记组合、组合、ODOD值与免疫细胞组化、原位杂交值与免疫细胞组化、原位杂交技术相结合技术相结合 细胞生物学功能细胞生物学功能1 1.粘附细胞的分选：物理化学特性，细胞亚群粘附细胞的分选：物理化学特性，细胞亚群2 2.激光细胞显微外科及光陷阱激光细胞显微外科及光陷阱(optical trap)optical trap)技术：技术：激光刀：细胞穿孔、灼烧细胞器、切割染色体、激光刀：细胞穿孔、灼烧细胞器、切割染色体、切除神经细胞突起切除神经细胞突起 光陷阱：利用激光的增强效应，钳制或移动细胞光陷阱：利用激光的增强效应，钳制或移动细胞器、染色体，进行细胞融合、改建、神经丝去除器、染色体，进行细胞融合、改建、神经丝去除3 3.荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术(Fluorescent Redistribution After Photobleaching,FRAP)l高浓度脉冲使细胞某一区域荧光淬灭，记录周围高浓度脉冲使细胞某一区域荧光淬灭，记录周围非淬灭荧光分子扩散至淬灭区的时间，了解细胞非淬灭荧光分子扩散至淬灭区的时间，了解细胞连接的多少、细胞骨架的组装等连接的多少、细胞骨架的组装等l荧光标记物：荧光标记物：CFDAamCFDAaml细胞间通讯连接的影响因素：细胞间通讯连接的影响因素：PH,CaPH,Ca2+2+,cAMP,cAMP等等FRAPFRAP荧光粹灭漂白恢复法荧光粹灭漂白恢复法 举例举例l荧光染料：二乙基羧化荧光素荧光染料：二乙基羧化荧光素 (carboxyfluorescein diacetate(carboxyfluorescein diacetate，CFDA)CFDA)l标本：大鼠膀胱逼尿肌细胞（细胞培养）标本：大鼠膀胱逼尿肌细胞（细胞培养）l分组：实验组，可见荧光恢复现象分组：实验组，可见荧光恢复现象 干预组（加干预组（加GJGJ阻断剂），无荧光恢复现象阻断剂），无荧光恢复现象l观察时间：光漂白后观察时间：光漂白后0 0，2 2，4 4分钟分钟ABCDPhysiology Chart(Time:16:07:24)30.0040.0080.00120.00160.00Int.40.0080.00120.00160.00200.00sChannel 1ABCDPhysiology Chart(Time:16:02:59)30.0040.0080.00120.00160.00200.00Int.60.00120.00180.00240.00300.00sChannel 14 4、膜流动性的测定、膜流动性的测定l细胞膜荧光探针受到极化光的刺激激化后，细胞膜荧光探针受到极化光的刺激激化后，l发射光的极性依赖于荧光分子的旋转，发射光的极性依赖于荧光分子的旋转，l而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围膜流动性，周围膜流动性，l故极性测量可以反映膜的流动性故极性测量可以反映膜的流动性5 5.光活化技术或称光笼锁（光活化技术或称光笼锁（cagedcaged）化合物技术化合物技术 l笼锁化合物又称光致不稳定笼锁化合物笼锁化合物又称光致不稳定笼锁化合物(Photolabile caged compounds)Photolabile caged compounds)，l通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式存在。通常是可逆的。惰性前体形式存在。通常是可逆的。l原理：紫外线照射原理：紫外线照射共价键断裂共价键断裂释放生物释放生物活性分子活性分子 笼锁化合物的两种光化学反应原理：笼锁化合物的两种光化学反应原理：偶氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯偶氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光致分解作用的光致分解作用1 1.偶氮苯衍生物：偶氮苯衍生物：l偶氮苯衍生物具有顺式和反式立体同分异构体，偶氮苯衍生物具有顺式和反式立体同分异构体，其药理性质不同，其药理性质不同，l并可用不同波长光照以控制两种同分异构体间的并可用不同波长光照以控制两种同分异构体间的转化。转化。l早在经典的笼锁化合物问世以前，已有乙酰胆碱早在经典的笼锁化合物问世以前，已有乙酰胆碱激动剂与偶氮苯结合生成光敏物质激动剂与偶氮苯结合生成光敏物质Bis-QBis-Q。lBis-QBis-Q顺式无活性，用顺式无活性，用420420-440nm-440nm光照后即转化成光照后即转化成反式而激活，再经过反式而激活，再经过340340nmnm光照后又变成顺式。光照后又变成顺式。lBio-QBio-Q与电生理技术结合用于研究电鳗和电鳐的乙与电生理技术结合用于研究电鳗和电鳐的乙酰胆碱受体。酰胆碱受体。2 2.邻硝基甲苯衍生物：邻硝基甲苯衍生物：l目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯的光敏性质合成。的光敏性质合成。l当生物活性分子与硝基甲苯结合即暂时失活，当生物活性分子与硝基甲苯结合即暂时失活，故又将后者称为掩蔽基团或笼锁基团。故又将后者称为掩蔽基团或笼锁基团。l一旦受到光照，连接于侧链碳原子的前体即解一旦受到光照，连接于侧链碳原子的前体即解离而释放出活性分子、质子和亚硝基副产物。离而释放出活性分子、质子和亚硝基副产物。笼锁神经递质、调质及抗体笼锁神经递质、调质及抗体 例：光照解笼锁例：光照解笼锁 NPE-NPE-氨甲酰胆碱氨甲酰胆碱血管平滑肌收缩（氨甲血管平滑肌收缩（氨甲酰释放）酰释放）CagedCaged入入CellCell途径：诱入法，酯化法，电途径：诱入法，酯化法，电极导入法，膜片钳全细胞方式导入法极导入法，膜片钳全细胞方式导入法CLSM的优点的优点1 1.激光是单色光、激光是单色光、LMLM观察、荧光观察观察、荧光观察2 2.um.um（“显微显微CTCT”）3.3.图象以电信号形式记录、储存，可修饰图象以电信号形式记录、储存，可修饰伪彩、测定细胞参数，直接获得图象伪彩、测定细胞参数，直接获得图象4 4.图形经精细调焦的光束成像，清晰度高图形经精细调焦的光束成像，清晰度高5 5.可活体观察、动态观察可活体观察、动态观察四、四、CLSM 使用步骤使用步骤 （一）样品准备（一）样品准备l培养细胞，如用钙培养细胞，如用钙Fluo-3Fluo-3可用市售培养皿可用市售培养皿l紫外激发，盖玻片制成培养瓶底紫外激发，盖玻片制成培养瓶底l活组织切片：甘油封片，无自发荧光活组织切片：甘油封片，无自发荧光（二）（二）选择荧光探针选择荧光探针l10001000余种余种l钙：钙：Fluo-3/am(Fluo-3/am(水溶性水溶性)不用紫外光激发，不用紫外光激发，可渗透细胞。可渗透细胞。Fluo-2Fluo-2用紫外激发，不穿透，用紫外激发，不穿透，需用需用MicroinjectionMicroinjectionl观察细胞内观察细胞内PHPH：SnarfSnarf荧光素中插入萘而合荧光素中插入萘而合成，可与成，可与Fluo-3Fluo-3或或Fluo-2Fluo-2联合测定细胞内联合测定细胞内钙与钙与PHPHCLSMCLSM常用荧光探针常用荧光探针l细胞内钙：细胞内钙：Fluo-3,Rhod-1,Indo-1,Fura-2Fluo-3,Rhod-1,Indo-1,Fura-2lDNA&RNA:DNA&RNA:碘化丙锭碘化丙锭PI,PI,吖啶橙吖啶橙AOAOl膜电位：膜电位：DiBAC4DiBAC4lPHPH值：值：SNARFSNARF类，疏水性探针用类，疏水性探针用AmAm形式形式l细胞间通讯：细胞间通讯：6-6-carboxyfluorescent diacetate,6-CFDAcarboxyfluorescent diacetate,6-CFDAl细胞内活性氧；细胞内活性氧；H2DCFDAH2DCFDAlImmunocytochemistry multipole staining,DNA chipImmunocytochemistry multipole staining,DNA chip：Cy3,Cy5Cy3,Cy5CY3 redCY5 GreenLiving dye-Green Fluorescence protein(GFP)下村脩下村脩(Osamu Shimomura)1962年从一种水母年从一种水母身上分离出绿色荧光蛋白身上分离出绿色荧光蛋白(GFP)(GFP)绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白GFPGFP分子结构图分子结构图 lGFPGFP是一种由是一种由238238个氨基酸构成的柱状蛋白。个氨基酸构成的柱状蛋白。l外围由外围由折叠片围绕，折叠片围绕，l内部则是一个线状的内部则是一个线状的-螺旋通过其长轴从中间螺旋通过其长轴从中间穿过。穿过。Douglas Prasher Douglas Prasher 19921992年克隆出了年克隆出了GFPGFP基因基因 l当当GFPGFP受紫外光或蓝光受紫外光或蓝光激发时，激发时，-螺旋包含的螺旋包含的发色团会发出绿色荧光。发色团会发出绿色荧光。l由于这一特点及其无种由于这一特点及其无种属限制，属限制，GFPGFP作为荧光标作为荧光标签被广泛用于细胞水平签被广泛用于细胞水平上的监测生物活动。上的监测生物活动。20082008诺贝尔化学奖由下村脩诺贝尔化学奖由下村脩(Osamu Shimomura)(Osamu Shimomura)、Martin Chalfie Martin Chalfie 和钱永健和钱永健 (Roger Tsien)(Roger Tsien)三人分三人分享，代表了绿色荧光蛋白研究上的三个里程碑享，代表了绿色荧光蛋白研究上的三个里程碑 l在在GFPGFP基因上突变几个不同的位点形成增强型绿基因上突变几个不同的位点形成增强型绿色荧光蛋白色荧光蛋白(enhanced GFP,EGFP)enhanced GFP,EGFP),黄色（黄色（EYFPEYFP）,黄绿色（黄绿色（ECFPECFP）和兰色（和兰色（EBFPEBFP）的活体荧光蛋白。的活体荧光蛋白。l这些荧光蛋白都具有稳定、无细胞毒性、灵敏这些荧光蛋白都具有稳定、无细胞毒性、灵敏度高度高,不需反应基质（不需反应基质（substratesubstrate）等优点等优点,又称又称为单标记系统（为单标记系统（single tag systemsingle tag system）。The Discovery of Aequorin and GFP 标记标记CFPCFP和和GFPGFP的脑皮质神经元的脑皮质神经元小鼠脑部邻近神经元可小鼠脑部邻近神经元可以随机表达不同颜色的以随机表达不同颜色的GFP(GFP(称之为称之为XFPs)XFPs)转染转染pEGFPpEGFP载体后载体后2424h h可见神经干细胞集落内有可见神经干细胞集落内有少量少量GFPGFP阳性细胞。阳性细胞。(荧光荧光+普通光相差显微镜普通光相差显微镜100100倍倍)加血清加血清4848h h后，神经干细胞集落内和周边均有后，神经干细胞集落内和周边均有GFPGFP阳性细胞。阳性细胞。(荧光普通光相差显微镜，荧光相差显微镜荧光普通光相差显微镜，荧光相差显微镜400400倍倍)l最重要是能用于活细胞和蛋白质进行实时定位最重要是能用于活细胞和蛋白质进行实时定位和观察，不需特殊的激发光谱，故又将此组荧光和观察，不需特殊的激发光谱，故又将此组荧光蛋白称为自动荧光蛋白蛋白称为自动荧光蛋白(autofluorescent autofluorescent proteins,AFPsproteins,AFPs)。l红色荧光蛋白红色荧光蛋白(RFPRFP)是从海产的是从海产的IndoPacific IndoPacific sea anemone relative Discoma Striiatasea anemone relative Discoma Striiata 中分中分离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名为为DsRedDsRed。1 1.神经细胞参数测定及三维重建神经细胞参数测定及三维重建 细胞外形细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究神经骨架重组的研究五、在神经生物学的应用五、在神经生物学的应用2 2.神经递质、调质及细胞内活性物质受体的荧光定神经递质、调质及细胞内活性物质受体的荧光定位位3 3.细胞内钙离子的测定细胞内钙离子的测定 细胞内信号传导的研究细胞内信号传导的研究 钙内流与神经递质释放的关系钙内流与神经递质释放的关系 微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释放微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释放4 4.细胞内细胞内PHPH值的测定，脑缺血，损伤时细胞内值的测定，脑缺血，损伤时细胞内PHPH变变化化 5 5.荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术(FRAP)FRAP)与细胞间通讯研究与细胞间通讯研究 Gap junctionGap junction的分布，密度，调控因素，网络的分布，密度，调控因素，网络阻断剂阻断剂(Othanol,Dieldrin)Othanol,Dieldrin)6.6.激光手术切除神经细胞突起激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体7 7.神经细胞编程性死亡神经细胞编程性死亡(programmed cell programmed cell death,PCD)death,PCD)与细胞内钙的关系与细胞内钙的关系 与细胞内与细胞内PHPH的关系的关系划痕负载法计算公式划痕负载法计算公式l红色：大分子红色：大分子RB200RB200l绿色：小分子绿色：小分子Lufic YELLOWLufic YELLOWlRB200RB200只可通过划痕处损伤细胞膜进入只可通过划痕处损伤细胞膜进入lLyellowLyellow可通过划痕及可通过划痕及Gap JunctionGap Junction进入进入l两者进入两者进入-黄色黄色l扩散率扩散率=Y-R/Total NumberY-R/Total Numberl思考题：思考题：结合结合1-21-2个例子，简述激光共聚焦扫描显微个例子，简述激光共聚焦扫描显微镜技术在生物医学中的应用。镜技术在生物医学中的应用。l名词解释：名词解释：荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术(Fluorescent Fluorescent Redistribution After Redistribution After Photobleaching,FRAP)Photobleaching,FRAP)光笼锁（光笼锁（cagedcaged）化合物技术化合物技术