大豆食品中异黄酮含量

大豆食品中异黄酮含量1 范围本标准规定了大豆食品中异黄酮（大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄苷） 含量测定的高效液相色谱法。本标准适用于原料大豆及豆浆、豆腐、腐乳等大豆食品中异黄酮含量的测定。本标准测试方法的线性范围：0.5卩g/mL100yg/mL。本标准测试方法的检出限：2.5卩g/kg。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义3.1 大豆异黄酮（soybean isoflavones）大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物，属于天然黄酮类物质，具有异黄酮类化合 物的典型结构。大豆中以异黄酮葡萄糖苷和相应苷元形式存在的物质，包括大豆苷（Daidzin）、染料 木苷（Genistin）、大豆苷元（Daidzein）、染料木素（Genistein）、黄豆黄素（Glycitein）、黄豆黄苷 （Glycitin）。其分子式如下：大豆苷（C H 0 ）、染料木苷（C H 0 ）、大豆苷元（C H 0 ）、染料木21 20 921 20 1015 10 4素（C H O ）、黄豆黄素（C H O ）、黄豆黄苷（C H O ）。15 10 516 12 522 22 104 原理样品经过乙腈-水溶液震荡提取，提取液经离心、浓缩后用80甲醇定容、过滤，经高效液相色谱分析（C柱分离），在260nm条件下测定，依据保留时间定性，用外标法定量。185 试剂和材料本标准使用符合GB/T 6682-2008规定的一级水。除另有规定仅使用分析纯试剂。5.1 试剂5.1.1 甲醇（Methanol, CH3OH）：色谱纯。5.1.2 乙月青（Acetonitrile, C2H3N）：色谱纯。5.1.3 二甲基亚砜（DMSO, C2H6OS）。5.1.4 冰醋酸（AceticAcid，CH3COOH）。5.2 试剂配制5.2.1甲醇溶液（体积分数80%）：取800 mL甲醇（5.1.1）用水定容至1000 mL，混匀。5.2.2 二甲基亚砜-乙腈-甲醇溶液（1：2： 2体积比）：取10mLDMS0（5.1.3）和20 mL乙腈（5.1.2） 用80%甲醇（5.2.1）定容至50 mL，混匀。5.2.3乙酸溶液（体积分数0.1%）：取1 mL冰醋酸（5.1.4）用水定容至1000 mL，混匀。5.2.4乙酸乙腈溶液（体积分数0.1%）：取1mL冰醋酸（5.1.4），用乙腈（5.1.2）定容至1000 mL, 混匀。5.3 标准品5.3.1 大豆苷元（Daidzein, C15H10O4，CAS 号：486-66-8,纯度：三98%）。5.3.2 染料木素（Genistein, C15H10O5，CAS 号：446-72-0,纯度：三98%）。5.3.3 黄豆黄素（Glycitein, C16H12O5，CAS 号：40957-83-3,纯度：三98%）。5.3.4 大豆苷（Daidzin, C21H20O9，CAS 号：552-66-9,纯度：三98%）。5.3.5 染料木苷（Genistin, C21H20O10, CAS 号：529-59-9,纯度：三98%）。5.3.6 黄豆黄苷（Glycitin, C22H22O10, CAS 号：40246-10-4,纯度：三98%）。5.4 标准品配制5.4.1大豆异黄酮标准储备溶液：使用分析天平（6.2）分别准确称取6种大豆异黄酮标准品1mg分 别置于容量瓶中，加入1mL二甲基亚砜-乙腈-甲醇溶液（5.2.2），充分溶解，配制成1mg/mL的单 标标准储备液。-18C避光保存，有效期6个月。5.4.2大豆异黄酮单标标准中间溶液：分别移取0.5 mL标准品储备液（5.4.1），加入80%的甲醇溶 液（5.2.1）于5 mL容量瓶中定容，混匀，配制成0.1 mg/mL单标标准中间溶液。0C-4C冷藏避光保 存,有效期3个月。5.4.3大豆异黄酮混合标准工作溶液：分别吸取单标标准中间溶液（5.4.2） 0.025 mL、0.05 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、5 mL,置于 5 mL 容量瓶中，用 80%甲醇溶液（5.2.1）定 容，分别配制成各组分浓度为 0.5 yg/mL、1 yg/mL、5 yg/mL、10 yg/mL、20 yg/mL、30 yg/mL、40 yg/mL、 50 yg/mL、100 yg/mL系列大豆异黄酮混合标准工作液用以制作标准曲线。0C-4C冷藏避光保存，有 效期1周。6 仪器和设备6.1 高效液相色谱仪： 配有四元梯度泵系统、柱温箱、紫外检测器、色谱工作站。6.2 分析天平：感量0.00001 g和0.0001 go6.3 旋转蒸发仪。6.4 恒温摇床。6.5 冷冻离心机： 转速不低于8000 r/mino6.6样品筛：60 目 o6.7 超声波振荡器。6.8 破壁料理机。6.9 组织粉碎机。6.10滤膜：孔径为0.22 ym的有机滤膜。6.11 真空冷冻干燥机。6.12 液相进样瓶：带有预开口聚四氟乙烯盖的棕色瓶，1.5 mL。7 试样制备与保存7.1 试样制备7.1.1 大豆取样品200 g500 g,用组织粉碎机（6.9）粉碎，使其全部通过样品筛（6.6），混匀，装入洁净 而干燥的容器密封备用。7.1.2 豆浆取100 mL豆浆通过冷冻干燥（6.11）制成粉末并记录冻干粉质量，装入洁净而干燥的容器，密封备 用。7.1.3 豆腐（干）、腐乳等大豆食品取一定质量的豆腐或其他豆制品经冷冻干燥（6.11）制成粉末并记录冻干粉质量，装入洁净而干燥 的容器，密封备用。7.2 试样保存试样于4C以下避光保存。试样制备过程中，应防止污染或组分变化。8 操作步骤8.1 提取准确称取试样0.1glg （精确至0.001 g）于离心管中，向其中加入0.5mL5mL乙腈（5.1.2）、 0.55mL水，密封后充分混匀，在室温条件下，使用摇床（6.4）以300r/min的速度振荡提取2h。然后 以10000 r/min的速度，在25C下离心（6.5） 5min，取上清液过滤。35C旋转蒸发仪（6.3）浓缩至 干，向其中加入5 mL10 mL 80%甲醇溶液以溶解干物质，通过针头式过滤器过0.22卩m有机相滤膜 （6.10）过滤上机待测。同时，做试剂空白。8.2 色谱参考条件色谱参考条件如下：a）色谱柱：C8柱（5ym、4.6mmx250mm）,或相当型号色谱柱。b）流动相A：含有0.1%乙酸溶液（523）。流动相B：含有0.1%乙酸乙腈溶液（524）。c）流速：1.2mL/ min。d）柱温：35Coe）检测波长：260nm。f）进样量：10此。g）梯度洗脱条件：见表1。表1 梯度洗脱条件时间/min0.1%乙酸溶液/mL0.1%乙酸乙腈溶液/mL08515384161082181280202076242573273369313665353885154085158.3 测定8.3.1 定性分别将大豆异黄酮单标标准溶液（5.4.3）按色谱条件（8.2）进行高效液相色谱测定，依据单一标 准品的保留时间，对大豆异黄酮各组分进行定性分析，定性色谱图参照附录A。8.3.2 定量8.3.2.1 标准曲线制作将不同浓度梯度标准溶液（5.4.3）按色谱条件（8.2）进行高效液相色谱测定，绘制以峰面积为纵 坐标、各大豆异黄酮单体浓度为横坐标的标准曲线。8.3.2.2 样品分析将已进行前处理的试样（7.1）按色谱条件（8.2）高效液相色谱测定，保证样品溶液各异黄酮单体 浓度总和在标准曲线检出范围内，若超出线性范围则需要对样品进行适当稀释，得到检测结果后，对应 标准曲线得到原样品溶液中各异黄酮单体的浓度。9 结果与计算9.1 试样中大豆异黄酮各组分含量按式（1）计算试样中大豆异黄酮各组分含量（yg/ g）;v （As - b） x v x九Xi = （1）a x m式中：Xi-试样中各异黄酮单体含量，卩g/g；As 试样样品中各异黄酮单体的峰面积值；b 标准线性回归方程中的截距；v -蒸干后重新溶解的体积，mL；入-稀释倍数；a标准品线性回归方程中的斜率，mL/ ug；m 样品取样质量，go结果保留3位有效数字。9.2 试样中总大豆异黄酮含量试样中大豆异黄酮总含量按式（2）计算：X总订Xi式中：X总厂一试样中总大豆异黄酮含量，单位为ug/g； Xi-试样中各异黄酮单体含量，单位为ug/go结果保留3位有效数字。9.3 样品中大豆异黄酮含量液体样品中大豆异黄酮含量按式（3）计算：XwX 总 xmiV(3)式中：X样液体样品中总大豆异黄酮含量，卩g/mL；X总试样中总大豆异黄酮含量，卩g/g；m.液体样品冻干后质量，g;V液体样品冻干时体积，mL。结果保留3 位有效数字。固体或半固体样品中大豆异黄酮含量按式（4）计算：(4)XW式中：X样-一-固体或半固体样品中总大豆异黄酮含量，卩g/g；X总试样中总大豆异黄酮含量，卩g/g；m.固体或半固体样品冻干后质量，g;m固体或半固体样品冻干时质量，g。10 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的差值不应超过算数平均值的10%。