食品毒理学第6章

第六章第六章 一般毒性作用一般毒性作用根据接触毒物时间的长短，可将产生的一般根据接触毒物时间的长短，可将产生的一般毒性作用分为急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性作用分为急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。毒性。按毒物接触时间长短所进行的观察和评价毒按毒物接触时间长短所进行的观察和评价毒效应的试验即为急性毒性试验、亚慢性毒性效应的试验即为急性毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验。试验和慢性毒性试验。6-1 急性毒性作用急性毒性作用 一、概念一、概念急性毒性急性毒性(acute toxicity)：指机体（实验动物或人）：指机体（实验动物或人）一次或一次或24小时内多次接触外源化学物后在短期内小时内多次接触外源化学物后在短期内 所产生的毒性效应。包括一般行为和外观改变、所产生的毒性效应。包括一般行为和外观改变、大体形态变化及死亡效应。大体形态变化及死亡效应。注意：注意：1.急性接触的次数：一次或急性接触的次数：一次或24h内多次。内多次。2.中毒效应出现的时间：一般为中毒效应出现的时间：一般为714天。天。3.中毒效应的强度。中毒效应的强度。二、急性毒性试验的目的二、急性毒性试验的目的 1.测试并求出毒物的的致死剂量以及其他急性毒性测试并求出毒物的的致死剂量以及其他急性毒性 参数，通常以参数，通常以LD50为最主要参数，并根据为最主要参数，并根据LD50的的 大小进行急性毒性分级。大小进行急性毒性分级。2.通过观察动物的表现、毒作用强度和死亡情况，通过观察动物的表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂 量反应关系和对人体产生损害的危险性。量反应关系和对人体产生损害的危险性。3.为亚慢性、慢性毒性试验研究以及其他毒理试验为亚慢性、慢性毒性试验研究以及其他毒理试验 提供接触剂量和观察指标选择的依据。提供接触剂量和观察指标选择的依据。4.为毒理学机制研究提供线索。为毒理学机制研究提供线索。三、急性毒性试验方法要点三、急性毒性试验方法要点1实验动物的选择实验动物的选择（1）原则原则（2）具体要求具体要求（3）实验动物的性别：雌雄各半。）实验动物的性别：雌雄各半。（4）实验动物的分组与数量：一般）实验动物的分组与数量：一般46组，组，每组每组10只。只。（5）实验动物的预检：）实验动物的预检：12周的检疫期。周的检疫期。（6）实验动物的给药前禁食处理）实验动物的给药前禁食处理大鼠、小鼠：隔夜禁食（禁食大鼠、小鼠：隔夜禁食（禁食4h）；染毒后禁食）；染毒后禁食4h。禁食时要保障饮水。禁食时要保障饮水。尽量选择尽量选择对化学毒物的代谢和毒效应表现对化学毒物的代谢和毒效应表现 与人的反应尽可能一致的实验动物与人的反应尽可能一致的实验动物；易于饲养管理、试验操作方便的动物；易于饲养管理、试验操作方便的动物；繁殖生育力较强、数量较大能够保障供应；繁殖生育力较强、数量较大能够保障供应；价格较低，易于获得。价格较低，易于获得。实验动物的物种和品系实验动物的物种和品系 首选哺乳动物，大小鼠最为常用。首选哺乳动物，大小鼠最为常用。大鼠大鼠：Spragur-Dawley（SD），），Wistar 小鼠：昆明种，小鼠：昆明种，NIH，ICR实验动物的年龄和体重：刚成年，且健康、未曾实验动物的年龄和体重：刚成年，且健康、未曾 交配和受孕的动物。交配和受孕的动物。大鼠：大鼠：180240克克小鼠：小鼠：1825克克同一次试验、同一批实验动物的体重变异范同一次试验、同一批实验动物的体重变异范围不得超过其平均体重的围不得超过其平均体重的20。常用剂型：常用剂型：水溶液；混悬液；油溶液。水溶液；混悬液；油溶液。试验前新鲜配制。试验前新鲜配制。受试物染毒量规定：受试物染毒量规定：小鼠小鼠0.2ml/10g0.2ml/10g，一次灌胃体积不超过一次灌胃体积不超过1.0ml/1.0ml/只只 大鼠大鼠1.0ml/100g1.0ml/100g，一次灌胃体积不超过，一次灌胃体积不超过5ml/5ml/只只3染毒方法染毒方法 灌胃灌胃2受试物及处理受试物及处理试验所用受试物的总量应一次备齐，且应试验所用受试物的总量应一次备齐，且应 为同一批号。为同一批号。受试物成分与配方应稳定不变。受试物成分与配方应稳定不变。4剂量选择与分组剂量选择与分组5毒性作用观察毒性作用观察中毒体征及发生过程；中毒体征及发生过程；死亡情况和时间分布；死亡情况和时间分布；体重；体重；病理检查。病理检查。6观察时间和周期观察时间和周期观察时间：染毒当天应连续或多次观察，以观察时间：染毒当天应连续或多次观察，以后每天后每天2次或多次观察直至试验结束。次或多次观察直至试验结束。观察周期：一般是观察周期：一般是14天。天。7.计算计算LD50(1)(1)查阅文献查阅文献了解化学毒物的理化特性，生产批号及纯了解化学毒物的理化特性，生产批号及纯 度，杂质成分与含量等。度，杂质成分与含量等。确定使用哪一种计算方法求确定使用哪一种计算方法求LDLD5050，然后再设计剂，然后再设计剂 量分组。量分组。LDLD5050的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍恩氏法等。的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍恩氏法等。找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学 物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系 和相同接触途径所测得的和相同接触途径所测得的LDLD5050值作为受试化学物的值作为受试化学物的 预期毒性中值。预期毒性中值。（2 2）预试验）预试验 设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计并在该剂量的上下各设计l l2 2个剂量组作为预个剂量组作为预 试验剂量。试验剂量。根据确定的剂量组进行染毒。根据确定的剂量组进行染毒。根据预试验的死亡资料确定组距。根据预试验的死亡资料确定组距。可根据以下公式计算出剂量分组：可根据以下公式计算出剂量分组：i=(lgLDi=(lgLD9090-lgLD-lgLD1010)(n-1)(n-1)或：或：i=(lgLDi=(lgLD100100-lgLD-lgLD0 0)(n-1)(n-1)式中式中i i为组距为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差相邻的两个剂量组对数剂量之差)；n n为设计的剂量组数。为设计的剂量组数。（3 3）正式试验）正式试验 根据试验设计所选用的根据试验设计所选用的LDLD5050计算方法来确定组数。计算方法来确定组数。例如，几率单位法、寇氏法一般设例如，几率单位法、寇氏法一般设5 51010个剂量组；个剂量组；霍恩氏法固定设霍恩氏法固定设4 4个剂量组。个剂量组。求得求得i i值后，以最低剂量组值后，以最低剂量组(LD(LD0 0或或LDLD1010)的对数剂量的对数剂量加上一个加上一个i i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。组剂量的真实值。1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6 LgLD0 LgLD0+i LgLD0+2i LgLD0+3i LgLD0+4i 死亡和死亡时间死亡和死亡时间重点观察和记录每只动物死亡的时间，特重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。动物的死亡数。体重体重 在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察 体重的变化。体重的变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重改变的原因很多：体重改变的原因很多：*若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少 甚至拒食，表现为体重减轻；甚至拒食，表现为体重减轻；*若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也 会减轻；会减轻；*如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能 在体重上反映出来。在体重上反映出来。寇氏法（寇氏法（Karbor）1.预试验：预试实验预试验：预试实验 取小鼠取小鼠16只，随机分只，随机分 成成4组，组间剂量之比为组，组间剂量之比为2:1。记录各组动物。记录各组动物 死亡率，粗略获得最大的不致死量（死亡率，粗略获得最大的不致死量（LD0）和最大的致死量（和最大的致死量（LD100）。）。2.正式试验正式试验动物数：除另有要求外，一般设动物数：除另有要求外，一般设510个剂个剂 量组，每组量组，每组610只动物为宜。只动物为宜。剂量确定：在剂量确定：在LD0与与LD100之间按等比级数之间按等比级数插入几个中间剂量组。相邻剂量公比，按下式插入几个中间剂量组。相邻剂量公比，按下式计算：计算：i=(lgLD100-lgLD0)(n-1)（1）n为欲分组数；为欲分组数；则各组剂量分别为下列各数值的反对数：则各组剂量分别为下列各数值的反对数：lgLD0 lgLD0+i lgLD0+2i lgLD0+3i lgLD0+4i.。设通过预试验，求得普鲁卡因的设通过预试验，求得普鲁卡因的lgLD0为为164mg/kg,lgLD100为为250mg/kg，准备分成，准备分成5组进行实验，各组组进行实验，各组剂量为多少？剂量为多少？将以上数据代入公式（将以上数据代入公式（1）：）：i=0.046故各组剂量分别为故各组剂量分别为164，182，203，225，250mg/kg给药及观察：取体重给药及观察：取体重1822g小鼠小鼠80只，只，随机分为随机分为5组，每组组，每组16只，按上述求得的只，按上述求得的 剂量分组给药，腹腔注入盐酸普鲁卡因，剂量分组给药，腹腔注入盐酸普鲁卡因，观察并记录死亡百分率。观察并记录死亡百分率。结果记录结果记录 (只只)剂剂 量量 D(mg/kg)LogD=X 死亡数死亡数(只只)死亡率死亡率(%)p 16 250 2.3979 15 94.0 0.94 16 225 2.3522 13 81.3 0.813 16 203 2.3075 8 50.0 0.50 16 182 2.2601 5 31.3 0.313 16 164 2.2148 1 6.3 0.063 LD50计算计算寇氏法：寇氏法：LD50=log-11/2(xi+xi+1)(pi-pi+1)改良的寇氏法：改良的寇氏法：LD50=log-1Xm-i(p-0.5)，式中：式中：Xm为最高剂量的对数值为最高剂量的对数值（log250=2.3979）；）；p 为各组动物的死亡率，以小数表示为各组动物的死亡率，以小数表示(如如80%写作写作0.8)；p为各组动物死亡率的总和为各组动物死亡率的总和(p1+p2+p3+p4+p5)；i为相邻两组剂量为相邻两组剂量(D)对数值之差，即：对数值之差，即：log250-log225=0.0457。p=2.626 LD50=log-12.3979-0.0457(2.626-0.5)=200(mg/kg)四、急性毒性分级和评价四、急性毒性分级和评价我国食品毒理急性毒性分级法我国食品毒理急性毒性分级法(1994)急性毒性分级急性毒性分级大鼠经口大鼠经口LD50(mg/kg)大致相当于大致相当于70kg人的致死量人的致死量6级级(极毒极毒)1稍尝稍尝,150001050克克外源化学物急性毒性分级（外源化学物急性毒性分级（WHO）毒性分毒性分级级大鼠一次经口大鼠一次经口LD50 (mg/kg)6只大鼠吸入只大鼠吸入4小小时，死亡时，死亡24只的只的浓度浓度(ppm)兔经皮兔经皮LD50(/mg/kg)对人可能致死的估计量对人可能致死的估计量g/kg总量总量(g/60kg)剧毒剧毒1105151000 6-2 蓄积毒性作用蓄积毒性作用 一、基本概念一、基本概念1蓄积作用（蓄积作用（accumulation）：外源性化学）：外源性化学物质连续反复地进入机体，其吸收速度或总量物质连续反复地进入机体，其吸收速度或总量超过代谢转化排出的速度或总量时，化学物质超过代谢转化排出的速度或总量时，化学物质就可能在体内逐渐增加并贮留，这种现象称为就可能在体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学物质的蓄积作用。化学物质的蓄积作用。2物质蓄积（物质蓄积（material accumulation）：当实验）：当实验动物反复多次接触化学毒物后可以用分析方法在体动物反复多次接触化学毒物后可以用分析方法在体内测出其原型或代谢产物时，称为物质蓄积。内测出其原型或代谢产物时，称为物质蓄积。3功能蓄积（功能蓄积（function accumulation）：化学）：化学物质长期接触机体后，机体内虽不能测出其原形的物质长期接触机体后，机体内虽不能测出其原形的型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用，称之为功型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用，称之为功能蓄积。能蓄积。二、研究目的二、研究目的蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，要内容之一，目的是通过试验求出蓄积系数目的是通过试验求出蓄积系数K K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。供参考。三、研究方法三、研究方法（一）蓄积系数法（一）蓄积系数法1蓄积系数：是多次染毒使半数动物出现效蓄积系数：是多次染毒使半数动物出现效应或死亡的蓄积剂量应或死亡的蓄积剂量ED50(n)与一次染毒与一次染毒使半数动物出现相同效应（或死亡）的剂量使半数动物出现相同效应（或死亡）的剂量ED50(1)的比值。的比值。KED50(n)ED50(1)KLD50(n)LD50(1)2实验方案实验方案（1）固定剂量法）固定剂量法（2）剂量递增法）剂量递增法（3）剂量固定的）剂量固定的20天蓄积法天蓄积法（二）生物半减期法（二）生物半减期法蓄积系数法是一种以生物效应为指标，用蓄积系数法是一种以生物效应为指标，用经验系数（经验系数（K）评价蓄积作用的方法，即）评价蓄积作用的方法，即将多次染毒与一次染毒所产生的毒性效应将多次染毒与一次染毒所产生的毒性效应（或死亡）进行比较。（或死亡）进行比较。固定剂量法：固定剂量法：先求出先求出LDLD5050，选取相同条件的选取相同条件的4040只动物，分为两组（染毒组只动物，分为两组（染毒组 和对照组），每组至少和对照组），每组至少2020只，雌雄各半。只，雌雄各半。试验组在试验组在1 12020l l5 LD5 LD5050的范围内选定一个的范围内选定一个 剂量，每日以固定剂量、定时和相同途径进行剂量，每日以固定剂量、定时和相同途径进行 染毒染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。试验期间观察记录每组动物死亡数。当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。计算累积总接触剂量计算累积总接触剂量LDLD5050(n)(n)，根据公式计算，根据公式计算 K K值，值，按下表进行评价。按下表进行评价。若接触剂量已累积达到若接触剂量已累积达到5 5个个LDLD5050剂量，也可终止试验。剂量，也可终止试验。蓄积毒级分组蓄积毒级分组蓄积系数蓄积系数(K)高度蓄积高度蓄积K1 1明显蓄积明显蓄积11K3 3中度蓄积中度蓄积33K5 5低度蓄积低度蓄积K5 5蓄积系数分级标准蓄积系数分级标准剂量递增法：剂量递增法：6-3 亚慢性和慢性毒性亚慢性和慢性毒性 一、亚慢性毒性作用一、亚慢性毒性作用1概念：亚慢性毒性（概念：亚慢性毒性（subchronic toxicity）是指实验动物或人连续是指实验动物或人连续较长期较长期接触接触较大剂量较大剂量的的外源性化学物所产生的中毒效应。外源性化学物所产生的中毒效应。2亚慢性毒性试验的目的亚慢性毒性试验的目的3亚慢性毒性试验的方法要点亚慢性毒性试验的方法要点研究受试物亚慢性毒性剂量反应关系，确定研究受试物亚慢性毒性剂量反应关系，确定 未观察到有害作用的剂量（未观察到有害作用的剂量（NOAEL）和可观察）和可观察 到有害作用的最低剂量（到有害作用的最低剂量（LOAEL），提出安全），提出安全 限量参考值。限量参考值。观察受试物亚慢性毒作用特点和毒作用靶器官。观察受试物亚慢性毒作用特点和毒作用靶器官。观察受试物亚慢性毒性作用的可逆性。观察受试物亚慢性毒性作用的可逆性。为慢性毒理试验的剂量设计和观察指标选择提供为慢性毒理试验的剂量设计和观察指标选择提供依据。依据。为受试物毒性机制研究和将研究结果外推到人提为受试物毒性机制研究和将研究结果外推到人提供依据。供依据。（1）实验动物的选择）实验动物的选择物种和品系物种和品系一般要求选择两种实验动物：一般要求选择两种实验动物：啮齿类（大鼠：啮齿类（大鼠：Wistar和和SD）非啮齿类（犬：非啮齿类（犬：Beagle犬）犬）性别、年龄和动物数性别、年龄和动物数两种性别，雌雄各半；两种性别，雌雄各半；初断乳动物，大鼠初断乳动物，大鼠68周龄，体重周龄，体重80100g；大鼠每组不少于大鼠每组不少于20只，犬、猴每组不少于只，犬、猴每组不少于6只。只。微生物学、寄生虫学等级和饲养环境微生物学、寄生虫学等级和饲养环境亚慢性毒性试验要求大鼠应使用清洁级及以上亚慢性毒性试验要求大鼠应使用清洁级及以上等级，并饲养在屏障环境内进行试验。等级，并饲养在屏障环境内进行试验。（2）染毒方式）染毒方式应尽量选择与人接触途径相似的方式；应尽量选择与人接触途径相似的方式；应与预期进行的急性毒性试验的接触途径相应与预期进行的急性毒性试验的接触途径相 一致。一致。染毒频率多为每日一次，连续染毒频率多为每日一次，连续90天。天。在进行食品安全性评价时一般采用经口染毒在进行食品安全性评价时一般采用经口染毒 途径。途径。有三种方式：灌胃法、喂饲法、胶囊法。有三种方式：灌胃法、喂饲法、胶囊法。剂量设计的原则：剂量设计的原则：最少设三个剂量组和一个阴性（溶剂）对照组。最少设三个剂量组和一个阴性（溶剂）对照组。高剂量组应能引起明显的毒性或少量动物高剂量组应能引起明显的毒性或少量动物 死亡（少于死亡（少于10）；）；低剂量组应无中毒反应，相当于未观察到低剂量组应无中毒反应，相当于未观察到 有害作用剂量（有害作用剂量（NOAEL）；）；理想的中剂量组约相当于观察到有害作用理想的中剂量组约相当于观察到有害作用 的最低剂量（的最低剂量（LOAEL）。）。剂量设计剂量设计高剂量：高剂量：1/20LD501/5LD50三个剂量组间的组距应为三个剂量组间的组距应为310倍，不少于倍，不少于2倍。倍。以实际摄入量的以实际摄入量的100倍作为其中一个剂量。倍作为其中一个剂量。（3）剂量选择和分组）剂量选择和分组（4）观察指标）观察指标一般指标：一般指标：*外观体征、行为活动；外观体征、行为活动；*动物体重；动物体重；*饲料消耗量饲料消耗量实验室检查：实验室检查：*血液学检查：血液学常规指标血液学检查：血液学常规指标*血液生化学检查血液生化学检查系统尸解和组织病理学检查系统尸解和组织病理学检查*脏器重量和脏器系数脏器重量和脏器系数*病理学检查病理学检查 其他指标其他指标4.亚慢性毒性评价亚慢性毒性评价最大无作用剂量小于或等于人的可能摄入最大无作用剂量小于或等于人的可能摄入 量的量的100倍者表示毒性较强，应放弃该受倍者表示毒性较强，应放弃该受 试物用于食品。试物用于食品。最大无作用剂量大于最大无作用剂量大于100倍而小于倍而小于300倍者，倍者，应继续进行毒性试验。应继续进行毒性试验。大于或等于大于或等于300倍者则不必进行慢性毒性试倍者则不必进行慢性毒性试 验，可进行安全性评价。验，可进行安全性评价。二、慢性毒性作用二、慢性毒性作用1概念：慢性毒性（概念：慢性毒性（chronic toxicity）是）是 指实验动物或人长期（甚至终生）低剂量指实验动物或人长期（甚至终生）低剂量 反复接触外源性化学物所产生的毒性效应。反复接触外源性化学物所产生的毒性效应。2慢性毒性试验的目的慢性毒性试验的目的研究慢性毒性剂量反应关系。研究慢性毒性剂量反应关系。为制定为制定ADI提供依据。提供依据。观察慢性毒作用特点和毒作用靶器官。观察慢性毒作用特点和毒作用靶器官。观察慢性毒作用的可逆性。观察慢性毒作用的可逆性。为毒性机制研究和将毒性结果外推到人提供依据。为毒性机制研究和将毒性结果外推到人提供依据。3慢性毒性试验方法要点慢性毒性试验方法要点实验动物选择：大鼠每组实验动物选择：大鼠每组4060只。只。染毒途径和时限染毒途径和时限经口，每周经口，每周56次；次；2年或终生。年或终生。剂量分组剂量分组观察指标（同亚慢性毒性试验）观察指标（同亚慢性毒性试验）l根据亚慢性毒性试验的根据亚慢性毒性试验的LOAEL来确定：来确定：高剂量：高剂量：1/51/2LOAEL；中剂量：中剂量：1/501/10LOAEL；低剂量：低剂量：1/100LOAEL。l如无亚慢性毒性资料，可参照如无亚慢性毒性资料，可参照LD50值来确定：值来确定：高剂量：高剂量：1/10LD50；中剂量：中剂量：1/100LD50；低剂量：低剂量：1/1000LD50。剂量设计原则：剂量设计原则：高剂量组不能出现明显中毒，但要有轻微的毒高剂量组不能出现明显中毒，但要有轻微的毒性反应；性反应；中剂量应相当于慢性毒作用的阈剂量；中剂量应相当于慢性毒作用的阈剂量；低剂量组应相当于最大无作用剂量。低剂量组应相当于最大无作用剂量。4.慢性毒性评价慢性毒性评价 最大无作用剂量小于或等于人的可能摄入最大无作用剂量小于或等于人的可能摄入 量的量的50倍者，表示毒性较强，应放弃该受倍者，表示毒性较强，应放弃该受 试物用与食品。试物用与食品。最大无作用剂量大于最大无作用剂量大于50倍而小于倍而小于100倍者，倍者，经安全性评价后，决定该受试物可否用于经安全性评价后，决定该受试物可否用于 食品。食品。最大无作用剂量大于或等于最大无作用剂量大于或等于100倍者，则可考倍者，则可考 虑允许使用于食品。虑允许使用于食品。