培训讲义10-16

液相色谱培训讲义(十）作者：转载自：发布日期:005-2第十一章 柱子的应用与维护 色谱柱的液相色谱系统获得分离的中心部件，许多分离问题都归结于色谱柱.对柱注意适当的维护，则可缓解许多故障的发生. 柱故障主要是由机械、色谱或者化学方面的原因引起的。维护色谱柱和排除故障,；需要懂得液相色谱的分离过程以及色谱柱本身的构造是非常重要的.色谱柱的价格昂贵，应避免人为地损坏,并尽可能延长其寿命。一、色谱柱的种类与评价 一般地说,根据样品的性质决定采用何种液相色谱方法，然后再选择不同类型的柱。即不同类型的柱则代表了不同的色谱方法。 不同种类色谱柱的差异在于柱结构、柱填料和柱尺寸的不同。 色谱柱有不同的尺寸(长度和内径），分制备型、常规分析型和微型。不同类型柱的硬件也不同，（包括接头、柱管等方面),还有径向加压柱和夹套加热柱等. 不同液相色谱法的尺寸根据需要可以选取,普通分析330长，内径48mm。常用20cm长、4.6mm内径的柱.制备型柱内径一般为8m、cm长。微型柱内径mm，长10c。不同的填料分析的效果可能不同,这是因为生产过程不同所致.同一厂商生产的同种填料因批号不同也会有差异，这种差异可能从基质就开始(表面积、杂质、特殊处理)，还有键合的化学物质(一氯或三氯硅烷反应剂)，不同厂家生产的填料还会因专利技术（预处理、键合过程、填装技术）等不同而呈现较大差异。由于种种差异、仅能假设同一批号的柱有基本相同的性质。 多数柱填料基质采用多孔硅胶微粒，通常有球形和无定形两种，具有不同的粒度、孔径和表面积。多孔聚合物微粒也适用于反相色谱。聚合物柱的流动相范围广，流动相pH值可在1至13之间。而硅胶基质H仅能在25和7之间。显然，聚合物柱要好一些,但目前仍是以硅胶基质的柱为主.原则上,聚合物柱可以克服硅胶基质柱的某些不足,但需要大量的实验来证实，要进一步考查聚合物基质填料的全面优越性。 在实际工作中，选择性能良好的柱可得到好的结果，首先要注意柱径、长度、填料种类和填料粒度。 评价柱的好坏不仅只是数，还应考虑组分在柱上的保留、键合相表面的物性、柱压降以及峰不对称因子As等。每一根新柱都应标出详细参数，主要内容包括公司名称、柱名称（商标）、柱填料、尺寸。附一张标准参考色谱图，并标出色谱条件、样品名称、流动相组成、流速、柱温、进样体积、检测器、峰的保留时间及峰名称等.评价一根色谱柱的主要指标是：塔板数值;峰不对称因子s;柱压降;键合相浓度。二、色谱柱预防性保护与柱寿命的延长 通常，一根色谱柱在分析数千个样品之后性能仍然保持良好，但也有的柱仅分析不多的样品后几乎就报废了.影响柱寿命和其它问题的因素很多，而有些因素是操作者很难控制的,如果被分析的样品（如分析生物样品)，怎么净化样品也是“脏”的，对于色谱柱的影响是非常大的。然而采取下列措施后,在多数情况下总能够人为地减少柱上故障,达到延长寿命的目的。1、加流路过滤器和保护柱 流路过滤器紧靠进样阀后面，位于分析柱前.。5m烧结不锈钢片夹在死体积很小的套子中，挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒入柱。因为每个样品都过滤既费事又带来误差，样品量少过滤更困难,因此流路上装过滤器是比较省事的办法。也可以在流路加上保护柱，放在流路过滤器和分析柱之间，或者代替流路过滤器。保护柱的使命是收集阻塞柱进口的来自样品的化学“垃圾。这种垃圾最终降低柱效能。保护柱是消耗品，分析5010个比较脏的样品之后就要调换新的.保护柱应该是小体积,用分析柱的同种填料填装。保护柱使用得当，对分离无影响，好像未装保护柱一样。有些厂商的商品将保护柱和流路过滤器连在一个单元内,使用起来非常方便。自己填装保护柱都是用短柱、不超过3cm长，内径23mm，用较大粒度的填粒（1520m）干法填装,会使分析柱效略微有所降低。2、避免高压冲击 一般色谱柱都能经得起高压，但经不起突然变化的高压冲击。引起高压突然冲击,主要是因样品阀的缓慢转动、泵起动快、柱切换操作等。转动六通进样阀时从泵到柱的液流会瞬时切断.在阀的泵侧压力升高,在阀的柱侧压力降低（变化超过20%)。阀转到底后压力突然冲击一下恢复正常.手动进样阀的变化不大，自动进样阀比较慢,可能造成压力冲击，可用氦气代替空气驱动进样阀。因氮压缩系数小.另外泵起动不应过快,可分步操作.如用3mL/mn流速,先从lmLmn到2mLm，然后再3L/min，每个间隔应大于20s。柱切换技术的应用也很广泛，切换过程中在色谱柱的入口处压力在零到很大数字之间变化,会很快使柱报废。3、分离条件 多数色谱柱有很宽的试验条件范围，但具体应用又受到限制，主要是pH值、柱温和流动相的选择。 硅胶为基质的键合相要求P在2。57之间,极端pH的流动相能“溶解”硅胶，使键合相流失.结果非碱性组分的保留不断减少，碱性组分的保留增加,引起碱性组分峰变宽。如果一定要用高或低pH的流动相，可加预柱(饱和柱).预柱装在泵和进样阀之间，用分析柱相同的填料填装，或者用普通硅胶.硅胶饱和了流动相,减少了分析柱填料的损失。预柱不要求柱效高，用价格低的一般硅胶疏松地填装，按期检查硅胶的溶解情况。用预柱也有不利的影响，即新流动相难以平衡,保留时间不稳定或稳定慢.使用了预柱一定要加流路过滤器,以防止硅胶微粒引起的麻烦。 以硅胶为基质的柱和阴离子交换柱超过60后,会增加对流动相中化学物质的吸附。在高温下用小颗粒柱引起柱床塌陷，降低柱效,改变峰形。在40以上使用m柱，70以上使用m柱，会使值降低5。 有些流动相中的溶剂不能用于某些柱,如小颗粒的聚苯乙烯填料不能用于非水的排阻色谱。另一方面,有些柱与某些溶剂（如四氢呋喃）一旦达到平衡，不要随意改用其它溶剂。有关这些特殊填料，可以参见有关资料。 水溶性流动相会引起微生物生长而造成阻塞柱。色谱柱应存放在纯有机溶剂或加了0%有机溶剂的水中。凝胶柱可存放在水溶性缓冲液中,同时加0.01%叠氮钠以防止微生物的生长。4、净化样品 用溶剂溶解的样品,多数组分在一定的时间内能完全从柱中流出来,不会造成危害.有些样品可能含有微粒物质，样品中的某种组分(如蛋白质)在柱头上沉积下来，组分在固定相上保留很强，溶剂带走柱填料等,这些都会造成柱效能下降或对柱寿命的影响，有必要采取措施防止柱变坏。 如在光线照射下观察样品是浑浊的或带有乳白色,进样前必须要过滤虽然流路上装有过滤器和保护柱，但不能代替样品的前处理，样品中过多的微粒会使过滤器和保护柱超载,很快阻塞，或者微粒进入分析柱,所以在进样前必须过滤样品. 若怀疑样品与流动相混合有沉淀而对色谱柱有阻塞，应先试验一下，看样品溶液加入流动相中有无变浑或乳白色出现。如果进样后压力突然增加而后又慢慢减小，表明样品中有微粒或发生沉淀。如有沉淀要设法改变分离条件,包括换样品溶剂和流动相或处理样品去掉不溶物质。应尽量用小体积的样品。 有些样品能很强地吸附在柱填料上，这样会降低塔板数,改变样品的保留物质外，还要加保护柱，定期清洗色谱柱。有时因为疏忽,用对柱有害的溶剂溶解样品，比如用molL的氢氧化钠溶解样品,这样的样品只要进500L到硅胶基质柱中，硅胶就很快溶解而使柱报废。在这种情况下，应立即中和样品,或除去原溶剂中的有害成分。5、用强溶剂定期冲洗柱 每次工作结束，用强溶剂冲洗柱是良好的习惯。可用甲醇、乙腈冲反相柱，冲去留在柱上的强吸附组分。用甲醇水为流动相时也应冲洗。冲洗的程序在以下章节中介绍。柱头的烧结不锈钢滤片，要求平整,死体积小，孔径适当(5m）。过滤片选择不好会改变色谱峰形，增加阻力或起不到阻挡污染物的作用（填料很快变色）。 此外，对柱硬件的保养也不可忽视。实际操作中应注意以下几点:接头要配套,用同一厂商的组接件；接头之间、柱压帽螺母与密封卡套之间无微粒(填料），否则收紧时容易咬死；密封卡套与柱管一次性卡紧后再也不能松动，所以拆开柱头再上紧时要小心，不能使卡套移动,原来柱端的不锈钢滤片和垫片的厚度和强度也不能改变(改变这些附件的性能就促使卡套移动；接头等组接件不要拧得过紧，适当上紧后接上泵试验,分步拧紧，直到不漏为止还有非常重要的是柱硬件的损坏往往会造成不可挽回的损失.综上所述,如何保护良好的柱性能与柱寿命:认真阅读色谱柱使用说明书;O使用填充良好的色谱柱；尽量减少压力波动,避免机械及热冲击；O使用保护柱及在线过滤器；O经常以强溶剂冲洗色谱柱；O充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分；O用稳定的固定相（C1最稳定）：O在中等p值操作时(68），用有机缓冲溶液；O色谱柱使用温度最好小于4;硅胶基质的色谱柱，应保持流动相的pH值范围在0。;O在水流动相与缓冲溶液中加200pm的叠氮钠；流动相中含有缓冲溶液,应注意用5：5的水及有机溶剂过滤,有机溶剂不能低于5;O过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液,用纯有机溶剂流动相保存（乙腈最好)。三、怎样选择色谱柱 现代高效液相色谱中,分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。1.硅胶基质填料（1）正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶（lica） 以及其他具有极性官能团，如胺基团（NH2APS)和氰基团（C，CP)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。 正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低 ，如：正己烷（eae）、氯仿（Cloroform）、二氯甲烷(MethyeClorde）等。（）反相色谱反相色谱用的填料常是以硅胶为基质表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱的顺序是极性较强的组份最先被冲洗出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有:C18（ODS）、C(MOS）、C4(butyl）、C6H（Pnyl）等.2.聚合物填料聚合物填料多为聚苯乙烯二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯等，其主要优点是在pH值为14均可使用。相对于硅胶基质的18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。 现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。3.其它无机填料 其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途.如，石墨化碳正逐渐成为反相色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体,又由于在HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何p与温度下使用。氧化铝也用于HL，氧化铝微粒刚性强,可制成稳定色谱柱柱床,其优点是可在pH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用。新型氧化锆基质色谱填料也可用于LC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用pH范围11，温度可达10.由于氧化铝填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中.四、怎样选择填料粒度 目前,商品化的色谱填料粒度从1到超过30m均有售，而目前分析分离主要用3、5和10填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压.粒度越小，填充柱的柱效越高;然而粒度越小，柱压越大,柱压的增加限制了粒度小于3m的填料应用。在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小粒度的填料是很有用的。3填料填充柱的柱效比相同条件下的填料的的柱效提高近0；然而,3m的色谱柱的背压却是5m的2倍。与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱，以缩短分析时间。另外,可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力.名称别名功能基团正相反相离子对应用ica非极性和中等极性以及非离子性有机化合物SSC1OH在所有的烷基键合相中对非极性于中等极化合物保留最弱;典型用于中等极性和多官能团化合物。tlC4（C3)3分离肚和蛋白质，保留时间比C8和18短。MOS,OyC4H9中等极性到强极性化合物，小肽和蛋白质，极性药物、甾族环境样品。DC18C87烷基键合相中对中等极性化合物保留最强。广泛用于药物、甾族化合物、脂肪酸和环境样品.PCN，Cn(pylitile）(CH）N对极性化合物有独特的选择性,适合应用于正相分离。当用于反相系统时，其选择性与和C1不同。在药学领域和复杂混合物的分离中应用广泛.APSNH2(Amno poy)（）3NH2反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交换，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性剂做流动相。正相中与硅胶的选择性不同,分析芳香族效果很好。hel-（C3） C3H芳香族化合物Diol（C2）OCH2（CH2O）反相时，分离肽和蛋白质。正相时，与硅选择性相似，但极性较弱SCX强阳离子次换（2)C6H4 SOH-有机碱SAX强阴离子交换(CH2）N+(（3)3有机酸、核苷和核苷酸五、如何选择保护柱 怎样选择保护柱，但又不影响分离分析？这是色谱工作者经常提出的一个问题。通常，在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁.对于大部分分析工作者来说，一支lc长的保护柱便能提供对柱子的保护，工作中发现要经常更换cm的保护柱,那么应选择m或3cm长的保护柱。保护柱越长，自然所装填的色谱填料越多，则其越能避免污染物进入分析色谱柱的机会。当然,随着保护柱的长度加长，样品的保留时间会比使用短保护柱长。一般来说，保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可. 保护柱的填料装填方式也很重要。目前有薄膜装填法的保护柱,使用过程很简单方便,而且可以在实验室中进行干装.但是,其最大的缺点是不经济，特别是针对中国的具体情况，一次性使用相对费用较高.另外,薄膜装填法的保扩性所装填的色谱填料有限,只能提供很有限的保护作用；不过也因为所装填的色谱填料较少，保护柱的长度也较短,所以对分析样品的保留时间的影响也很小。 另一种保护柱结构其实质是缩短了的色谱分析柱，设计方式上有直连式、手紧式或整体式。整体式设计是由色谱柱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的，必须与色谱分析柱一同订货，可以非常方便地使用，但不能够被修改.直连式结构设计可在任何时候由色谱工作者来安装连接，可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用,而且还可以根据样品的相关情况选择不同的保护柱一样,只是在连接时不需要借助扳手等工具,直接用手上紧即可。另外从保护柱结构的角度看，保护柱的结构又分为是否可以更换保护柱柱芯。现在大多数的保护柱均可以更换保护柱柱芯，可以降低保护柱的使用成本。大多数人是根据色谱分析柱的填料选择保护柱的填料，正常情况下可以选择与分析色谱柱一样的色谱填料。但是，根据实际的分析工作，也可不必与分析色谱柱的填料完全相匹配。 对于选择保护柱的原则是：在满足分析分离要求的前提条件下，尽可能地选择较短的保护柱结构，尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料.六、故障与解决的方法 选样了一根好的柱子,再加上有效的维护与预防,可以避免不少意外故障的发生。当然谁也不能保护色谱柱“永远”不出故障，任何一根色谱柱最终都会因为柱效下降直到报废。柱损坏的标志是：塔板数下降；峰形改变；压力增加；保留时间变化。有时往往是几种情况伴随着同时发生.、塔板数下降 在色谱柱使用过程中，塔板数会不断下降.一般情况下,进200个样品后柱效N值要降低5%，(但也不能一概而论）,而用18，柱梯度分析氨基酸，进10个血清样品之后,柱效就下降50.这两种情况的差别之所以这么大,关键在于处理样品的方法不同。 如果柱效很快下降，应考虑上节所提到的人为不利因素.值突然下降(如一个工作日内),应考虑柱头塌陷或进了不合格的样品.如果使用了不同系统的色谱柱造成柱效下降,是某系统中存在柱外效应。新建立的方法中柱效下降，可能是样品和其它内在因素引起,此时要采取相应措施,防止继续给柱造成危害。2、峰形变坏 出现拖尾峰、分叉峰或非高斯峰的原因很多,但总是与塔板数骤然下降联系在一起的。峰形变坏而保留时间不变，多半是柱受到阻塞（不锈钢烧结片），或者柱头有了空穴。 、压力增加 和柱塔板数不断减少一样，在使用过程中柱压慢慢增加，可视为正常.如果压力一下子增加过高,应考虑两种可能，一是样品沉积在柱内，二是柱内硬件阻塞（未考虑系统其它部分的阻塞）。 对于第一种情况，要用能溶解所用样品的溶剂冲洗。冲洗时拆开柱与检测器之间接头，正向冲洗或将柱出口接在泵上反向冲洗(如果柱条件许可)，使用大约30mL溶剂。不要让冲洗液通过检测器流动池，以防污染。在冲洗过程中不断检查，直到压力恢复正常为止。如冲洗无效，应该考虑是第二种情况，先换烧结不锈钢过滤片，拆下柱，拧开柱头上的压帽,持垂直方向小心取出不锈钢过滤片，换上新的（不是洗过的旧滤片）。换滤片时尽量不要搅动柱头填料,如有塌陷,可用同种填料中乙醇调成糊状补平柱头,压紧，压平,柱性能可恢复如前.如果柱头填料己脏，可挖去23mm，用新填料补平。、保留时间的改变 保留时间的变化指两种类型的情况,第一种是同一根柱样品间的保留变化，第二种类型主要是填料的差异造成的，许多实验都会碰到，现讨论如下。 不同牌号的色谱柱分离的色谱峰保留时间可在小范围内移动,但峰的顺序和分辨率不变，可改变流速或溶剂强度(反相色谱加水调节）进行校正。如果谱图中色谱顺序发生了变化,或者两峰重叠在一起,问题就比较严重.保留时间发生大的变化,主要由柱填料硅酸相互作用所致，另外有次级保留因素的影响。硅胶为基质的填料表面含有硅醇，有的封尾填料可部分去掉硅醇、不封尾填料的硅胶表面硅醇基更多。酸性或碱性分子可与硅醇发生不同程度的相互作用.硅酸与样品分子作用的强弱，因不同批号的硅胶和不键合相填料而异。即使同批号的硅胶而不同批号的键合相也有差异。硅醇对阳离子或碱性样品影响最大。参照下列要求做可以减少色谱柱之间保留时间的变化. （）仅用同一厂商的柱.实际上不具可操作性，但最起码作某一专门分析方法时要用同一厂商的柱. （2)设计分离条件，使保留值变化最小（建立标准的方法). (3)选用液相色谱系统或色谱柱对次级保留因素(外界）灵敏度最低。 (4)换新柱时调整分析条件保持旧柱的保留值（改变条件）。这一步工作是必不可少的，在长期的常规分析中，不会从头至尾用一根柱，中间总要换新柱，每换一次,都应仔细地调整各组分的保留. 在实际工作中，应考虑到可能会发生什么问题，怎样预防这些问题的发生. 第一，前面提到的作某一专门分析尽量用同一批号的柱。也可与厂商接洽，提出特殊的要求。 第二，选择硅醇影响最小的分离条件,减少柱间的差异。如在流动相中添加三乙胺抑制硅醇的作用。 第三,许多色谱工作者认为，在流动相中加入离子对试剂更能抗硅醇的干扰，使保留具有更好的重复性。 不管什么情况下引起保留值的明显变化，都应该改善分离条件。 改善特别差的峰的分离度，并使保留值稳定下来。例如用梯度洗脱分析体液中的氨基酸，这种复杂的样品有20多个组分，保留稍有变化可能对分离就产生灾难性的结果.一些极端组分，如偏向酸性或碱性的组分很易发生保留值的改变，应用不同流动相的组成、pH值和缓冲液的浓度,可以改善关键色谱峰间的分离。色谱峰分离度变差,可能会系统地改变保留值。 塔板数降低、压力增高、峰形变差、保留值变化可能同时发生,可能都是由柱引起的。下表的内容可帮助找到一些故障的原因，有些内容将在后面的章节中详细讨论。表1- 由柱引起的故障 故 障现象解决办法过滤片阻塞柱头塌陷键合相流失样品阻塞强吸附的样品压力增高，N下降，峰形差峰分叉,N下降保留改变，峰形差,下降高压N下降，保留减小倒柱冲洗或换过滤片修补柱头，可恢复80%以上换柱用能溶解样品的溶剂冲洗柱强溶剂反冲七、延长柱寿命的方法 一根柱到了不可使用的时候应更换。“不可挽救”这个概念在许多色谱工作者的认识上不完全相同，有人认为只有当柱的压力增高到系统不可承受的地步才考虑报废,只要压力在可接受的范围内总要设法修补，以延长柱的寿命。另外也可以从分析高要求的样品改作分析低要求的样品，从分离多组分的样品改作分离单组分的样品,从分离介质复杂的样品改为分离介质相对简单的样品。实验室最常用的延长柱寿命的方法是修补柱头、换不锈钢烧结片,冲洗、倒冲柱。 修补柱头和换不锈钢结片常联系在一起，前面已简单作了叙述。去掉过滤片后发现柱头塌陷或填料被污染,可用无水乙醇调成糊状的同种填料（挖去脏填料）填补柱头，用与柱内径相同的、顶端平而光滑的不锈钢或聚四氟乙烯棒压紧,再填平，再压紧,反复次，最后用无水乙醇将柱头四周润湿几次，擦干净柱外壁的填料、加上新过滤片,拧紧接头,接上泵冲洗，而后再接检测器。如果塌陷很深，或者挖去的脏填料很多，填平柱头后接上泵冲洗15n，再拆下柱填平，再接上泵冲洗，反复数次可恢复大部分柱效.有时还应该用比较高的流速才能有效。 修补过的柱一般不能恢复到原先的柱效，刚开始修补数次效果不错，随着修补次数的增多，维持一个短时间又要修补，到了后期，键合相随硅胶的溶蚀而流失,加上化学物质的腐蚀,此时再也无法修补了. 对价格高的柱一定坚持自己动手修补。如排阻色谱柱不随时间而改变保留，仅需比较低的分离条件,稍为修补就可解决问题。 倒冲柱也是经常采用的维护措施，不提倡新柱倒冲柱。色谱柱用到中后期,而且修补过多次后才考虑逆向反冲。可在倒冲柱前填平原柱头的塌陷现冲洗，也可倒向冲洗后再填平柱头（原柱出口)，后者效果好一些。柱逆向使用后柱效损失较大（约460%),常常可以倒过来再倒过去，只要不破坏柱床，效果还不错。倒冲柱前要检查柱两端的烧结过滤片情况，防止烧结过滤片(原柱头承受过度压力，填料被泵打出)。 在采取以上措施时,冲洗过程应伴随始终。 有少数实验室自己装柱，或请厂商装柱。柱硬件都是用过的旧柱，这可节约50的经费，但有时也碰到一些麻烦。柱内壁未经再抛光处理,柱壁效应比较大，分辨率降低,或者拖尾峰.重装柱后卡套易松动,整个柱头渗漏。可借助于聚四氟乙烯软膜密封，但已不能承受较高的压力。 对有些柱重新处理是值得的,但有些则无价值。除考虑价格外,还要考虑实际工作要求。任何柱都可以修补数次，样品处理好、流动相温和、压力中下可以减少修补柱的次数.柱压升高超过系统所承受的限度就要报废柱.实验室内要备有不同类型的散装填料(C1、硅胶）,用同类型、同粒度的填料修补柱头效果好。如果手头没有所要求的填料，可以用其它填料代替,这比用柱头塌陷的柱要好得多。八、如何解决色谱柱使用过程出现的问题1。保留值与分离度重现性不好原因分析问题原因表现不同色谱柱间差异使用期间柱变化填料、键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解强保留组分堆积堵塞保留因子（k），分离因子()柱效（N） 保留因子（）,分离因子(）柱效（N）保留因子（)，柱效()柱外效应系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等.柱效（N）分离效果变差流动相组分改变流速改变温度改变保留因子(k），柱效变化很小保留因子(k)，分离因子()保留因子（k），柱效变化很小柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子(k），柱效变化很小柱超载样品量太大保留因子(k），柱效（N）液相色谱培训讲义（十一)作者：转载自：发布日期:200-5八、如何解决色谱柱使用过程出现的问题1保留值与分离度重现性不好原因分析问题原因表现不同色谱柱间差异使用期间柱变化填料、键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解强保留组分堆积堵塞保留因子(）,分离因子(）柱效（) 保留因子（k）,分离因子(）柱效（N)保留因子(k)，柱效(N)柱外效应系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。柱效（N）分离效果变差流动相组分改变流速改变温度改变保留因子（k),柱效变化很小保留因子（k)，分离因子（）保留因子（k)，柱效变化很小柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子（）,柱效变化很小柱超载样品量太大保留因子（k）,柱效（N)。造成色谱峰(不对称)拖尾的原因（）色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料塌陷（2）柱头有污染(）样品超载(4）样品溶剂不合适（）柱外效应()化学或二次保留(硅羟基)效应(7)缓冲容量不足或不合适（8）重金属污染3.如何解决峰形拖尾的问题A、与化学有关的拖尾问题（1）流动相中，加入mM的三乙胺（用于碱性化合物）或醋酸胺(用于酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺；（2）如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺(或醋酸二甲辛胺)；(3）降低进样量到g.B、与色谱柱有关的拖尾问题(l)如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用2倍柱体积的96的二氯甲烷与4甲醇,加l氢氧化铵混合液冲洗；正向柱可用甲醇冲洗；（2）使用保护柱;C、与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽(1）进样体积过大,(通常25L）:（2）进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（最佳连接管应20cm,内径为0.007）；（3）检测器流通池的体积过大。4.如何贮存色谱柱(1）防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物,做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加ppm叠氮钠以抑制细菌生长(一定当心其毒性和潜在的爆炸性)；或在流动相中加20的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气.（2)尽可能将色谱柱贮存于00有机溶剂（乙腈最好)中,避免在缓冲液中保存.（）使用缓冲液后的色谱柱，应用1520倍柱体积的不含缓冲剂的同种水-有机溶剂流动相冲洗色谱柱换成100有机溶剂贮存。(4)避免用纯水冲洗键合致密的C8柱.（）将色谱柱两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。九、谱图问题 液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来,其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决，而其他的问题必须通过修改操作程序来解决，对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键.、峰拖尾原因解决方法1、筛板阻塞1、a、反冲色谱柱b、更换进口筛板c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷、填充色谱柱3、干扰峰3、a、使用更长的色谱柱、改变流动相或更换色谱柱、流动相pH选择错误4、调整pH值。对于碱性化合物，低pH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的活性点发生反应5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰b、更改色谱柱B、峰前延原因解决方法1、柱温低、升高柱温2、样品溶剂选择不恰当2、使用流动相作为样品溶剂3、样品过载3、降低样品含量4、色谱柱损坏4、见1、A2、峰分叉原因解决方法1、保护柱或分析柱污染1、取下保护柱再分析.也可更换保护柱。拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染，可运用适当的再生措施。若还不行，可能是入口处堵,可以更换筛板或色谱柱。2、样品溶剂不溶于流动相2、改变样品溶剂，如果可能，采取流动相作为样品溶剂D、含量高的成分峰原因解决方法、样品溶剂选择不恰当1、减少样品载量E、早出的峰变形 原因解决方法1、样品溶剂选择不恰当1、减少进样体积b、运用低极性样品溶剂F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原因解决方法1、柱外效应 1、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）b、使用小体积的流通池G、K增加时,脱尾更严重原因解决方法1、二级保留效应,反相模式 、a、加入三乙胺 、加入乙酸c、加入盐或缓冲剂、更换一支柱子、二级保留效应，正相模 2、a、加入三乙胺 b、加入乙酸c、加入水 d、试用另一种方法3、二级保留效应，离子对 3、加入三乙胺H、酸性或碱性化合物的峰拖尾原因解决方法1、缓冲不合适 1、a、使用浓度50-100lL的缓冲液b、使用Pka等于流动相值的缓冲液I、额外的峰 原因 解决方法、样品中有其他组分 1、正常2、前一次进样的洗脱峰 、a、增加运行时间或梯度b、使用pH等于流动相H的缓冲液3、空位或鬼峰 3、a、检查流动相否纯净b、使用流动相作为样品溶剂、减少进样体积J、保留时间波动原因 解决方法、温控不当 、重新设定柱温2、流动相组分变化 2、防止变化(蒸发、反应等）3、色谱柱没有平衡在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱K、保留时间不断变化原因 解决方法1、流速变化 1、重新设定流速2、泵中有气泡 、从泵中除去气泡、流动相选择不恰当 3、更换合适的流动相b、选择合适的混合流动相、基本漂移原因 解决方法1、柱温波动(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器较高灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。)1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器.2、流动相不均匀.（基线向上漂移，流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移）。2、使用HL级的溶剂，高纯度的盐和添加剂.流动相在使用前进行脱气，使用过程中用氦气、检测器内流通池被污染或有气体3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池,如有 需要，可以用mo的硝酸(不要用盐酸）.、检测器出口阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册换流通池窗。5、流动相配比不当或流速变化5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。6、柱平衡慢，物别是流动相发生变化时6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时,在分析前用1020倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。、流动相污染、变质或由低质量溶剂配成7、检查流动相的组成。使用高质的化学试剂及PL级的溶剂.、样品中有强保留的物质（高K值)以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线.8、使用保护柱,如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。9、使用循环溶剂，但检测器未调整。9、重新设定基线.如循环溶剂已超阶级出检测器动力学范围，使用新的流行动相。10、检测器没有设定在最大吸收波长.、将波长调整至最大吸收波长处。M、基线噪音（规则的）原因解决方法1、在流动相、检测器或泵有空气1、流动相脱气，冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。2、漏液2、见第三节。检查管路接头是否松动，泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。、流动相混合不完全3、用手摇动使混合均匀合均匀或使用低粘度的溶剂4、温度影响（柱温过高，检测器未加热)4、减少差异或加上热交换器5、在同一地线上有其他电子设备、断开L、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部，加以更正。6、泵脉冲6、在系统中加入脉冲阻尼器液相色谱培训讲义（十二）作者:转载自:发布日期：20072N、基线噪音(不规则的)原因解决方法1、漏液1、见第三节.检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查检测器流通池是否漏液。2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成、检查流动相的组成。3、流动相各溶剂不相溶3、选择互溶的流动相4、检测器内有气泡4、断开检测器的记录仪的电源，检查并更正。5、系统内有气泡5、用强极性溶液冲冼系统6、检测器内有气泡6、冲洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）7、用1N的硝酸(不能用磷酸）清洗流动池、检测器灯能量不足8、更换灯、色谱柱填料流失或阻塞、更换色谱柱1、流动相混合不均匀或混合器工作不正常10、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置。O、峰变宽原因解决方法1、流动相组成变化1、重新制备新的流动相2、流动相流速太低2、调节流速、漏液（特别是在柱子和检测器之间）见第三节。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及正常的噪音。如果必要更换密封。4、检测器设定错误、更改检测器参数设置5、柱子过载b、检测器响应时间过长或池体积过大c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径大d、模数转换频率过低5、a、小体积进样，稀释样品b、减少响应时间或使用更小的流通池c、使用内径为。0070.1的管路d、将模数转换频率增大6、缓冲液离子强度太低6、增加离子强度7、保护柱污染或失效、更换保护柱8、色谱柱污染或失效,塔板数降低、更换同样类型的色谱柱。、柱头污染或塌陷9、更换柱子、呈现两个或多个未被完全分离的峰10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果11、柱温过低或柱温不均匀1、选择设计合理的柱温设备，提高柱温。2、检测器响应时间太大12、使用较小的响应时间P、分离度降低原因解决方法1、流动相污染或变质(引起保留时间变化)1、重新配制流动相2、保护柱或分析柱2、取下保护柱再分析,也可更换保护柱，若问题仍然存在，可能是柱子被强留物质污染，再生色谱柱,若问题仍然存在,更换色谱柱。Q、所有的峰面积都变小/变大原因解决方法、检测器衰减设定过高/低1、减少/增加衰减的设定2、检测器响应时间太大、设定较小的响应时间3、进样量太少过多3、增大/减小进样量4、输出连接不当4、使用正确的连接十、色谱柱工作程序1。1新购的色谱柱（分析柱）须建立档案才能启用。2柱子的选用，原则上一根色谱柱只能用于同类物质的分析。1.使用色谱柱时，应在色谱柱前加同种填料和规格的保护柱（预柱)14色谱柱与预柱一经使用,就应该标明方向，不可倒过来使用。1.5柱子（预柱或分析柱）的连接.51预柱、分析柱与管路的连接，总的原则是要尽量避免死体积的增大。因而,在拧紧螺丝前一定要把不连接管尽量往柱子里塞。在使用通用接头时，即使在拧紧的过程中也要注意边塞边拧，以免在拧动的过程中，管子松开。预柱与分析柱的连接管应尽量短。5。2在使用不锈钢固定接头时，要注意不能拧得太紧，以免螺丝尖端的一截管子和金属刃环变形.不同公司的柱子的柱头不一样，插进去的管子的深度、刃环的角度也不一样,因而不锈钢接头不能通用.。6色谱柱的使用1.1流动相流速一般应在1.5mL/i以内，柱内径越大,可用的流速越大；填料颗粒越细，可用的流速越小。1。6.流动相的p值：以硅胶为载体的色谱柱，应在27.之间，最好在257.0之间，其它色谱柱参照说明书的规定.1.3使用含盐或缓冲液的流动相时,使用前一般先用10mL以上的水(或用无盐流动相)过渡。1。7色谱柱的清洗1。1对于无盐流动相，样品分析完成后,一般应用流动相继续冲洗6mL以上，再根据样品成分的溶解性质，选用合适的纯有机溶剂或水冲洗，必要时测定柱效.7。如果流动相含有盐或者缓冲液，先用相应的无盐流动相冲洗6mL以上,再用水冲洗100mL以上,再根据样品成分的溶解性质，选用合适的纯有机溶剂冲洗,必要时测定柱效。1.7。3色谱柱冲洗干净的确认:如果没有时间测定柱效,应保证柱压恢复正常；而且,在254nm处检测基线,20分钟内保持平稳.1.7。4预柱的冲洗：如果预柱太脏，应该单独冲洗,以免污染分析柱，国产的预柱必要时可以用长时间的倒冲的方法把脏物冲洗：henomene公司的预柱不能倒冲,如果预柱洗不干净，交由仪器管理人员处理，新预柱的柱压一般在100si以下，如果柱压变得很大，应考虑预柱已经变脏、被堵塞了。1.5柱效及分离度的测定15。1使用完毕,必要时用稠环芳烃测定柱效（不带预柱）,如果发现柱效下降,或分离度变差,必须查找原因，采用合适的溶剂进一步冲洗柱子，直到基本恢复正常.1。75。2测定方法：样品：00m（含苯0.ml联苯3g+萘20mg菲30mg)测定波长：254m；流动相：8甲醇水；进样量:。1.8色谱柱的封存:反相色谱柱应保存在50以上的甲醇/乙腈中，正相色谱柱应保存在正已烷中，存放达半年时要重新冲洗,以免溶剂挥发,柱床变形。1。记录：分析完成后应作记录。 1。10正反相的转换：由反相到正相，依次用水、甲醇-异丙醇-正已烷冲洗;由正相到反相的转换,依次用正已烷异丙醇甲醇水冲洗。1。11柱压及色谱柱压（不带预柱)上升，应查找原因,采用合适的溶剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃、氯仿、异丙醇、乙醚等)进一步冲洗柱子，直到柱效、柱压恢复正常.如果还不行，可以把柱子倒过来冲洗，不过须冲洗比较长的时间，因为柱床重新平衡需要一定的时间,倒过来冲洗,应倒着使用,不用再倒回去使用，以免又需再次平衡柱床(当然，倒着用一段时间后，如果柱压又上升了，还可以倒回去冲洗、使用)。每倒转一次,应重新测定柱效。1.12色谱柱的报废：色谱柱的报废没有具体的时间，有些色谱柱已不能用于测定某一物质了，但用于测另外的物质却可能还很好.一般经过多次维修，柱压仍太高时,可以报废。用稠环芳烃测得柱效测得柱效和分离度达不到,经过冲洗、修理仍无改善时，也可以报废。注意事项：反相柱不能用纯水冲洗,流动相中有机相的比例必须在5%以上。液相色谱培训讲义（十三）作者:转载自:发布日期：2072第十二章 液相色谱仪器故障及排除方法第一节 故障分类、识别与排除表本书中故障排除表的编排按照故障现象的分类（包括整机、部件、色谱图、引起原因等）加以整理，在许多情况下可能有重复描述的，这是因为一种故障症状的出现，往往是由许多原因造成，可以从色谱图中得到信息，也可以从各部件的运转情况推测,直至操作者应运用自己的全部知识与经验进行综合分析、推断、并通过各种可能的尝试，作出正确的判断。为了更加直观地快速判断问题所在。本章中,尽量用各种图表形式.表1 系统流路问题造成的基线故障排除方法症状可能原因解决方法不规则的噪声（产生于系统流路)检测器流通池内有较大气泡排气泡,清洗检测池或在检测器废液排放口加适当的回压调节器;在检测器废液排放回压不规则的噪声（产生于系统流路）流路中有少量气泡排气泡（为预防气泡，流动相要脱气或通氦气）系统不稳定或没达到化学平衡使系统所有部件（如柱和检测器）有适当时间获得稳定和化学平衡;如果使用自动梯度洗脱，要有足够的平衡时间获得好的再现性；如使用离子对试剂，在首次使用时需要足够的时间和溶剂体积，色谱柱才能达到足够的平衡。流动相被污染不使用这些流动相并且：（1）清洗贮液器,过滤器(6moL HN3）水（重复三次).甲醇/换溶剂入口过滤器（2）建议用PLC级试剂（)冲洗并重新平衡系统检测器流通池漏移开检测器盖子检查泄漏，如果看不到,按下面步聚进行:(）用可溶性好的非缓冲液溶剂清洗检测器,然后用甲醇清洗（2)通氦气或氦气，慢慢将检测池吹干检测器流通池漏监测基线噪声,如果噪声消失，表明检测池内部漏，需修理更检测池规则的噪声（产生于系统流路）检测器流通池漏监测基线噪声，如果噪声消失，表明检测池内部漏,需修理/更换检测池色谱柱被污染为证明可能的原因更换系统的色谱柱或使用一根同类的被证明性能好的色谱柱换流动相监测基线如果问题仍然存在可能由于：（1） 溶剂的性质（如不互溶）（) 流动相被玷污(3) 保护柱或管路过滤器被玷污表1-2 检测器电路引起的基线噪声故障排除方法症状可能原因解决方法无规则噪声(产生于检测器)检测器没有稳定检测器灯应有适当时间稳定（直到基线稳定）灯故障（产生于检测器）检测器灯检测器平衡时间的变化取决于使用的检测器种类和参数（如波长、灵敏度、电压/电流等）按检测器说明书检查器可以调证灯能量以补偿量损失无规则噪声（产生于检测器)检测池被污染参见检测故障排除检测器电路问题检测器故障，与供应商联系检测器与数据处理系统信号线连接不好将连接线接好检测器接地不好使用专用的、有屏蔽的信号线周围使用设备的影响使用单独电源，远离有强电磁波、强磁场的设备数据处理装置灵敏度设置太灵敏调到灵敏度合适的位置有规则期（分或秒）噪声（产生于检测器）周围设备的影响周围使用设备的影响参见上述“不规则的噪声”解决办法检测器内部控温器不合适（开关过于频繁）正确设置检测器内部控温参数长期(分或小时）有规则噪声（产生于检测器)室温波动稳定室温至系统完全平衡，如果问题继续存在,则：（1)将检测器置于无空气对流的恒温环境中()检测器避免阳光直射周围使用设备的影响参见上述“不规则的噪声”解决办法基线漂移（产生于检测器）检测器不稳定参见上述“不规则的噪声”解决办法室温变化参见上述“长期有规则噪声”解决办法检测池被污染参见检测器故障排除出现脉冲式噪声（产生于检测器）检测器灯参见上述“不规则的噪声”解决办法周围使用设备的影响参见上述“不规则的噪声”解决办法检测器电路问题检测器故障,与供应商联系表12-3 保留时间改变/错误的故障排除方法症状可能原因解决方法每次进样时的保留时间不重复由于气泡,各部件磨损等原则引起泵故障或泵脉冲输液不稳定如果压力不稳继续存在,见泵故障排除法系统不稳或未达到化学平衡应有足够时间使所有的部件(如检测器、柱等)达到平衡,注意使用的操作条件（如流动相、检测器数设置、检测器类型等）如果进行的是梯度洗脱,在两次进样期间应有足够的时间以保证再现性如使用离子对试剂应保证第一次使用时要有足够的时间和足够的溶剂体积使色谱柱达到平衡每次进样时的保留时间不重复进样体积太大或样品浓度太高（过载)平衡被破坏如果压力不稳继续存在，见泵故障排除法室温波动大稳定环境温度,如果问题继续存在，测:（）用柱恒温箱,(室温5以上）（2)将系统置于恒温、空气对流小的环境溶剂配比不合适解决步骤如下：(1)流动相预混合、过滤和脱气（2)用溶剂平衡色谱柱(）至少进标准样三次，比较保留时间的重现性，如果保留时间重现性好,表明是溶剂配比的问题保留时间变化-新的恒定值（重复但不正确)对样品来说流动相不正确或组成不对配制新的流动相泵流速改变设置合适的流速由于泵不稳导致输液流速不正确用称重法测量流速的准确性，如果测得值与设置值不同，证明是泵的问题，参见泵故障的排除室温变化参见“保留时间不重复的解决方法柱恒温箱温度设备有误设置正确的温度使用的色谱柱类型或尺寸不正确用一新的相同的色谱柱作比较保留时间变化至一新的恒定值（重复但不正确）流动相中有稳定剂或稳定剂改变使用无防腐剂的溶剂柱被污染参见“保留时间连续向一个方向增大或减小”的解决方法系统的梯度延迟时间设置不正确流路系统有无变化（如梯度混合气的加入，如果有变化重新计算新的延迟时间表124 不正常峰形的故障排除方法症状可能原因解决方法无峰检测器选择错误(如波长、灵敏度、自动回零等）设置正确的检测器参数检测器输出没回零检测器基线回零由于电源、电路检测池造成的检测器问题参见检测器故障排除检测器与数据处理装置线路连接错误检测器输出信号,正确连接使用错误的流动相配制新的流动相如果问题发生时系统压力很高，则表明样品中有沉淀样品降解验证样品的完整性,检查样品处理过程，更换新的样品色谱峰比预计的小（灵敏度降低）进样体积错误；进样器样品定量环大小不合适改变到合适的进样体积；检查进样器样品定量环，如需要更换合