PCR的基本步骤及注意

（DNApolymeraseI）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性，因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶（简称Taqpolymerase）,则是于1976年从温泉中的（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似修复复制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的，Dr.Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年化学奖。PCR原理DNA的是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合酶-Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90C以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板引物结合物在的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性一退火一延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩扩增放大几百万倍。PCR反应体系与反应条件1标准的PCR反应体系10X扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物200卩l引物10100卩l模板DNATaqDNA聚合酶卩lMg2+L加双或三蒸水100卩lPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物（PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。引物有多种设计方法，与PCR在实验中的目的决定。但基本原则相同PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu。分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构2、PCR引物设计PCR反应中有两条引物，即5端引物和3引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5端引物与位于待扩增片段5端上游的一小段DNA序列相同；3端引物与位于待扩增片段3端的一小段DNA序列互补。引物设计的基本原则 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌吟或的成串排列。 引物内部不应出现互补序列。 两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3端的互补重叠。引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。 引物的5端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。v引物设计软件Primer（自动搜索）*vOligo6（引物评价）vVectorNTISuitvDNAsisvOmigavDNAstarvPrimer3(在线服务)3、模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。4、PCR反应条件的控制 PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用L 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20200umol/L TaqDNA聚合酶(100ul) 引物浓度一般为L 反应温度和循环次数变性温度和时间95C，30s退火温度和时间低于引物Tm值5C左右，一般在4555C延伸温度和时间72C，lmin/kb(10kb内)Tm值=4(G+C)+2(A+T)循环次数：一般为2530次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。PCR步骤标准的PCR过程分为三步：变性(90C-96C):双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2退火(25C-65C):系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3延伸(70C-75C):在(在72C左右，活性最佳)的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端一3端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60C-65C间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。PCR检测PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（，）染色是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。PCR反应特点特异性强PCR反应的特异性决定因素为： 引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将（pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（卩g=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。简便、快速PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。PCR的循环参数1、预变性（Initialdenaturation）模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。2、循环中的变性步骤循环中一般95C,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。3、引物退火(Primerannealing)退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。4、引物延伸引物延伸一般在72C进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为lmin/kbp。5、循环数大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72C维持5-15分钟.使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。(四)PCR中的污染和假阳性PCR中污染主要来自1、样品间交叉污染；2、先前PCR产物遗留(carry-over)