胚胎干细胞的起源和同一性

胚胎干细胞的起源和同一性摘要胚胎干细胞在生物研究方面应用广泛，也作为研究哺乳动物早期发育的模型，但是它们精确的起源却是备受争议。传统上认为它们来源于植入前的胚胎，但这暗示着形成胚胎干细胞的细胞可能已经有发育为原始生殖细胞命运倾向的外胚层细胞产生，它通过原始生殖细胞系形成胚胎干细胞。根据最近的研究发现我们提出胚胎干细胞可以直接来源于早期的外胚层细胞，这些胚胎干细胞可以通过不同培养条件形成的两条不同路径出现。关键词：细胞，胚胎干细胞，同一性简介多能性是小鼠胚胎内细胞团形成外胚层的首要要求。在合适的培养条件下，内细胞团细胞可以在体外以胚胎干细胞的形式增殖。这些细胞保持有重新进入一个胚胎（形成嵌合体）的能力，使这些细胞发育为成体的所有组织，包括生殖细胞系和俗称为幼稚多能细胞。多能干细胞最初来源于小鼠睾丸的畸胎瘤。由于畸胎瘤相对其他组织而言在生殖细胞系中更常见可以推断这些畸胎瘤起源于干细胞；小鼠的睾丸瘤一般在出生后形成；在胎儿的睾丸小管中可以清晰的观察到初期的瘤。随后发现多能性细胞系很难与胚胎干细胞区分开来，这些胚胎干细胞来源于体外发育的小鼠重新编程的胚胎的原始生殖细胞。因此，捕获幼稚多能细胞的机会之窗在发育过程中打开两次：第一次在早期的外胚层而第二次在干细胞系。胚胎生殖细胞与胚胎干细胞的相似之处强烈暗示着胚胎干细胞可能来源于那些已经有发育为原始生殖细胞倾向的外胚层细胞。也有假说称是原始生殖细胞促进培养植入前和植入后发育阶段的胚胎形成外植体。在这个假说中，我们依据近来的发现猜想胚胎干细胞可能通过两条途径得到外植体：直接来源于新形成的外胚层，它处于幼稚多能状态；或者培养在进行遗传重编程的特定原始生殖细胞，使它们重获多能性（图1）。图1.幼稚多能细胞来源 在一定条件下分离小鼠的胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和原始生殖细胞。（A）体内发育过程。在囊胚后期的早期外胚层（红色）出现幼稚多能细胞系和受精后8.5天的原始生殖细胞（黄色）（B）体外培养到囊胚期的另一条产生幼稚多能细胞的途径。红心代表早期外胚层分离胚胎干细胞的路径；黄心代表通过形成原始生殖细胞而发育为胚胎干细胞的较长的路径。灰色箭头代表长期培养可能会得到胚胎干细胞或胚胎生殖细胞的假说。图示大小不代表真实比例。幼稚多能性的出现哺乳动物受精后产生一个发育为完整的胚胎的受精卵和形成胚外世系。受精卵经过几轮的卵裂之后产生均等的卵裂球，但是在囊胚阶段，出现了两个在形态上和分子上存在明显差异的世系。滋养外胚层的特征是上皮样特性和在其他特定标记中表达转录因子Cdx2（尾形同源框2），它主要对胎盘发挥作用，然而内细胞团分化为上胚层（其他方面认为是原始的外胚层）和下胚层-通常被认为是原始内胚层。至少在鼠胚植入阶段时上胚层和下胚层是完全不同的。每个都有自己的分子特征。尤其上胚层表达转录因子Nanog而下胚层表达转录因子Gata6和Gata4（Gata结合蛋白6和4）（图2A）。上胚层身份获得与雌鼠胚胎失活X染色体的再激活同时发生。X染色体的再激活也是胚胎干细胞成功形成的标志，可能也算降低染色质在外胚层难以建立幼稚多能状态难度的遗传学事件之一。外胚层形成时不要求内胚层的分化；那些携带基因编码成纤维生长因子（Fgf）/Erk（Ephb2-小鼠的基因组信息）通路元件突变的胚胎，像Grb2（生长因子受体结合蛋白2），缺少内胚层但是有明显正常的外胚层。Fgf/Erk通路的化学抑制剂完全抑制外胚层的发育，随后扩大外胚层（增殖）。用这种方式处理的胚胎外胚层细胞并不能完全抑制细胞本来发育的潜力；它们对正常的胚胎发生起作用，当注入宿主囊胚时形成功能性生殖细胞。随后植入，啮齿动物的外胚层从球状细胞发育为杯状上皮。这个形态上的变化由转录因子如Nanog和Rex1（锌指蛋白42，Zfg42-小鼠的基因组信息）表达量减少和上调Fgf5和短尾突变体完成。此外雌性胚胎的随机一条X染色体失活发生在交配后5.5天的整个外胚层。接下来几天里，生殖细胞系的特化开始于最近的最初表达Fgf5和短尾突变体的外胚层。干细胞前体特化是通过信号分子像由胚外外胚层和内源性内胚层分泌骨形态发生蛋白（BMPs）4和8b，随后被原始生殖细胞表达的标记基因像Stella（发育的多能性相关3，Dppa3-小鼠基因组的信息）Blimp1（调节远点包含1区段和锌指蛋白区段；Prdm1-小鼠基因组信息）和Prdm14所标识。体细胞的基因像同源框A1（Hoxa1），Hoxb1，Lim1（LIM同源框蛋白1，Lhx1-小鼠基因组信息）和Evx1（甚至是没有同源基因1的同系物）在Stella阳性的细胞里均被抑制，但是短尾突变体和Fgf8基因仍在这些细胞里表达，表明它们可以从外胚层的幼稚多能状态里转移并开始发育为体细胞。随后原始生殖细胞开始增殖，在妊娠中期沿着发育的后肠迁移到生殖嵴部位，这段时间一直表达POU区段的转录因子Oct4（Pou5f1-小鼠基因组的信息）。虽然一直认为Oct4是多能性的标识，事实上原始生殖细胞在体内是单能的；然而当它们在外植体或转化进畸胎瘤细胞时获得多能性。图2.鼠胚外胚层和内胚层的分离 （A）受精4.5天植入期左右鼠胚的共焦图像，免疫染色Nanog（红色）和Gata6（绿色）显示外胚层和内胚层各自分离。可见DAPI（蓝色）染色的滋养外胚层（B）胚胎干细胞在抑制有丝分裂的成纤维滋养层上生长的相差显微镜下的图像。尺寸：10m胚胎干细胞的分离最早成功从外胚层直接分离胚胎干细胞是在1981年。最初从早期胚胎中分离多能细胞系的动机是受畸胎瘤细胞研究的启发。不仅能自发出现在小鼠睾丸中，这些瘤细胞也可以在将卵圆筒期的胚胎移植到成年小鼠的过程中产生。未分化的胚胎瘤细胞系在人工培养的瘤里增殖，当注入宿主囊胚形成嵌合体时对许多组织起作用。保持多能性的培养条件需要有抑制有丝分裂的小鼠成纤维细胞滋养层和促进所选细胞的增殖，保持未分化状态的胎牛血清。允许囊胚（或分离的内细胞团）在解离之前完整发育几天后分离胚胎干细胞。有关分离胚胎干细胞的满意结果可以在更进一步培养得到的胚胎干细胞菌落确认（见图2B）。多年以来，胚胎干细胞的来源一直备受争议也很难理解。有趣的是，分离胚胎干细胞的设备显然依赖胚胎的遗传学背景；研究发现小鼠的129系通常可以复制，在原始培养步骤没有改变的情况下是不可能从CBA系胚胎分离到胚胎干细胞。一些试图构建外植体在生长中的变化和胚胎干细胞成功建立的联系的研究已经完成。例如Oct4的表达水平是一个在POU区段表达的转录因子和多能性的标识，在从小鼠的菌株移植的胚胎产物中显著下降，这些从129菌株移植的胚胎在Oct4水平上是耐胚胎干细胞分离的。甚至发现在129胚胎外植体里的Oct4表达区段在一些细胞发育的过程中是下降的，暗示胚胎干细胞的成功分离不仅依赖Oct4阳性细胞数量的增加，也可能需要遗传学和转录控制重置关键基因的表达，这可能会创造一个仿真的，诱导培养状态。正如我们在下面讨论的，为了细分胚胎干细胞的分离过程，理解胚胎干细胞的起源，很有必要重新精炼一下鼠类胚胎干细胞分离培养方案。在补充白血病抑制因子的培养基的培养方案里是可以重现滋养层细胞重要的自我更新功能，至少是在从小鼠129系胚胎分离胚胎干细胞时有效。近期在培养基中添加Bmp4或相关生长因子来代替血清并补充白血病抑制因子和Bmp4两种细胞因子，使有生殖细胞功能的胚胎干细胞在限定条件下增殖。不幸的是，即使在这限定条件下，依然不能有效地从小鼠非129系胚胎中分离有生殖功能的胚胎干细胞。从一系列小鼠种系中分离胚胎干细胞能力的显著变化与特定系在Erk信号转导中的多样性作用相关。Erk信号通路由小鼠早期胚胎产生的Fgf4和LIF独立激活。Erk的活动与胚胎干细胞的分化相关；抑制这条通路则促进胚胎干细胞的自我更新。抑制Erk的活动也可以提高从非129系小鼠胚胎分离胚胎干细胞的有效性。不能分离胚胎干细胞的种系已经被一种新方法淘汰。不是通过激活通路阻止分化，而是用小分子来抑制特定的激酶。这个新的胚胎干细胞培养方案被称为2i（两个抑制剂），它能够抑制Erk信号转导和淀粉合酶激酶（Gsk3）。从本质来讲，抑制发育中胚胎Erk信号转导促进终止分化前的活动。除非抑制Gsk3或激活Stat3信号通路，否则培养胚胎干细胞增殖的效率会很低，但是有关该过程的解救机制还没有完全弄清楚。Gsk3抑制剂可能促进处于2i培养环境的胚胎干细胞的翻译。，迄今检测到小鼠的种系在2i培养条件下的胚胎干细胞都可以有效的分离出来，包括之前被认为是最难分离出胚胎干细胞的非肥胖糖尿病小鼠。这个重要的发现证明了分离胚胎干细胞不需要特定的遗传诱因，但是胚胎干细胞的出现可以归结为小鼠早期发育的属性。植入后胚胎产生多能细胞系源自畸胎瘤的胚胎癌细胞在雄性性腺里的自发出现增强了人们对直接从原始生殖细胞里分离多能干细胞可能性的猜想。这由交配后8.5天鼠胚的后面部分在含白血病抑制因子，青灰因子和Fgf4的滋养层细胞培养得出来的结论。这些统称为胚胎生殖细胞系类胚胎干细胞。从交配后11.5-12.5天外植体的生殖嵴里也可以分离到胚胎生殖细胞，但是处在这个发育阶段的生殖细胞必须要经历印记消除，这个过程使胚胎生殖细胞形成嵌合体的能力减弱，尤其是形成生殖细胞系。分离胚胎生殖细胞在移出过程有短暂的Fgf的补充，暗示着它的增加触发了外胚层的重新编程。然而，如果原始生殖细胞直接在含白血病抑制因子的2i培养基里培养时Fgf作用就不是必需的。好像在这样条件下更易克服从原始生殖细胞向胚胎生殖细胞转化的障碍。这对研究Erk和Gsk3在抑制原始生殖细胞沿通常路径分化的能力起作用。植入后的小鼠外胚层出现了具有多能性的畸胎瘤。然而还不能直接从植入后的外胚层分离胚胎干细胞。近来用从人的囊胚分离干细胞系的培养条件在植入后鼠胚获得了多能性细胞；尤其是移植到一个滋养层细胞或纤连蛋白为基质激活素和Fgf2的补充培养基上。这些表皮干细胞不能从单个细胞有效的增殖，很难促成嵌合体。它们与从人胚胎分离的多能系的许多相同特征暗示人的胚胎干细胞可能代表一个比囊胚更晚的发育阶段（图3）。Fgf2对人的胚胎干细胞和表皮干细胞的分离和扩展起关键作用。表皮干细胞在形成和表观遗传学上与胚胎干细胞不同；表皮干细胞有表达Fgf5和短尾突变体的特征同时胚胎干细胞有表达Rex1和Kif4的特点，并且没有X染色体的失活。用像Kif4的单一的多能因子转染表皮干细胞可以使其通过重新编程而表现胚胎干细胞的标志性特征包括有生殖细胞系的功能。在有滋养层和白血病抑制因子的条件下长期培养也可以低水平的重新编程表皮干细胞。这可能由于它们反转到早期外胚层阶段或通过原始生殖细胞转化成胚胎生殖细胞。有趣的是，幼稚多能细胞能从单细胞中分离出来，它们是与小鼠植入后外胚层隔开的细胞，然后被移植到补充有血清和白血病抑制因子的饲养层培养基中，但这需要一个2-5周的培养期。图3.人类胚胎分离多能细胞系（A,B）从小鼠胚胎（A）和人类胚胎（B）分离的能细胞的比较。图中显示小鼠和人类胚在体内发育时间上的不同（天数）和体外多能细胞的外形。长期培养出现人类胚胎干细胞默认体外培养外植体细胞到能够分离表皮干细胞的植入后的鼠胚。胚胎干细胞的发生由于胚胎干细胞可以由外植体的内细胞团产生，传统认为它们等同与交配后3.5天小鼠囊胚期的内细胞团细胞。然而也可以从小鼠8细胞期的卵裂球分离胚胎干细胞。在从卵裂球分离胚胎干细胞的过程中，细胞分离引起“微型囊胚”环境在即将出现胚胎干细胞的地方形成。直接从在外胚层和内胚层分离之前已分开单个内细胞团的细胞分离得到胚胎干细胞方面的报道还没有。在一篇有关显微解剖受精后4.5天植入左右的小鼠胚胎的报道，Brook和Gardner决定性的证实胚胎干细胞起源于早期的外胚层，接着明显与内胚层分开。他们也展示了胚胎干细胞可以直接从单一外胚层细胞分离，这些来自新近恢复受精后4.5天胚胎外胚层的细胞是分开的，但是却是获得每个胚胎只有三个胚胎干细胞克隆的最大值的细胞。这导致胚胎干细胞在分离时可能俘获部分包括有特定的生殖细胞前体的外胚层细胞。然而在更多加有白血病抑制因子的2i培养基的培养条件时，可以观察到胚胎干细胞的克隆数目的增加。这表示所有外胚层细胞可能短暂的有变成胚胎干细胞的能力，尽管这种潜能的发挥依赖它们分开的时间和所处的培养环境。最近发表的文章证明了内细胞团在分离胚胎干细胞的生长时进行的显著的变化。用小鼠胚盘细胞在常规胚胎干细胞培养条件获得的细胞进行单-细胞基因表达分析，结果显示一个亚组的细胞分子外形在它们由内细胞团向胚胎干细胞转化过程中发生明显变化。这些变化包括上调与自我更新相关的基因像Lin28，Tcf3（转录因子3）和Nrob1（核受体o亚家族B组1号）和下调与发育中分化相关基因像Gata6，Cdx2和Floxd8，这与特定表观遗传学调节子水平包括Dnmt3a（DNA甲基转移酶3），Hdac5（组蛋白去乙酰酶5）和Cbx1（chromobox homologue 1）的具体变化是一致的。有趣的是参与原始生殖细胞特化的基因比例像fragilis（干扰素诱导的跨膜蛋白3；Ifitm3-小鼠基因组信息）。Blimp1和Prdm14在发育和合成胚胎干细胞时起轻微上调作用。这个观察结果佐证了整个外植体在含血清的条件下培养，可以诱导生殖细胞前体的发生。更进一步培养的话可能得到胚胎生殖细胞并产生多能细胞系。因此我们猜想在分离过程中幼稚多能细胞系的来源可能有两条选择的路径。第一个是当幼稚多能细胞系出现在新形成的外胚层里被捕获；第二个在发育培养中依赖诱导的生殖细胞系（图1）。人们很关注完成胚胎的单细胞基因表达分析及在2i培养基里分离胚胎干细胞时产生的胚胎干细胞系。意料之中不能检测到与原始生殖细胞相关的基因例如fragilis和Blimp1，也就不能证明胚胎干细胞是直接来源于早期的外胚层。胚胎干细胞分离时胚胎的滞育啮齿动物令人关注的一个性能就是胚胎的滞育潜能，它对便易分离胚胎干细胞意义重大。滞育是发生在小鼠和大鼠哺乳期母亲产生胚胎时的现象。滞育期胚胎发育到囊胚阶段便由透明带孵化，然后分离外胚层和内胚层，但是在雌激素恢复之前都处于未植入、未发育阶段。外胚层依然有表达Oct4和Nanog，雌性胚胎的两条X染色体均有活性。在滞育阶段的外胚层指明需要白血病抑制因子信号转导与早期外胚层和胚胎干细胞之间关系密切是一致的。滞育期的启动提高了分离胚胎干细胞的效率。这可能因为外胚层处于幼稚多能细胞状态时发育暂停，因此增加在培养时捕获这一阶段的可能性。已知哺乳动物没有滞育期，真正的胚胎干细胞依然没有分离出来而且对外胚层的发育细节也知之甚少（例如介入的相对时间，标识的表达和X染色体的再激活与失活）而这些细节有利于优化培养。不能产生真正的胚胎干细胞是否反映了幼稚多能状态发育的进化分歧即快速通过或绕过非啮齿动物或者现在的体外培养条件不适合捕获这个状态？管理非啮齿哺乳动物幼稚多能细胞的重要性需要提高培养条件，这可以促进外植体外胚层细胞发育成原始生殖细胞或从特定的原始生殖细胞重新编程为胚胎生殖细胞的进程。人类胚胎的多能细胞系人类胚胎干细胞和表皮干细胞相同的作用暗示着在分离时外胚层可能先发育到等同为植入后状态。尽管人类的多能细胞系在学术和药物研究方面应用广泛，但是它们在分化能力上有些受限并且通常它们比小鼠的胚胎干细胞更难操作。将来有可能分离到与小鼠的表皮干细胞相比更接近小鼠的胚胎干细胞的人类幼稚多能胚胎干细胞吗？一个近期的研究为实现这个目的提供了有利的证据，这个研究将关键的多能因子Oct4，Klf4和Klf12异常导入含白血病抑制因子和弗斯可林的2i培养基里的人 “胚胎干细胞”。这些条件促使细胞转化为具有小鼠胚胎干细胞特征包括有两条有活性的X染色体和对白血病抑制因子信号的应答性的细胞类型。是否可以设计一种策略维持早期外胚层细胞处于幼稚多能状态从而可以捕获人类胚胎干细胞还有待证明。这也许要求从滋养外胚层和胚外内胚层分离外胚层细胞或添加激酶抑制剂阻止外植体细胞发育为植入后外胚层状态。也许这些尝试是徒劳的，通过诱导外植体培养来捕获原始生殖细胞-胚胎生殖细胞之间的转化的进一步的研究是值得的。结论我们在这里讲的在体外可以通过两条选择的路径到达小鼠胚胎干细胞幼稚多能状态的可能性（直接通过早期外胚层或诱导原始生殖细胞来捕获），依赖它所处的培养条件和细胞环境。这反映了哺乳动物胚胎的多能性与生殖细胞系之间的复杂交织。我们选取不同的培养状态和不同的时间点的单细胞模型和外植体或内细胞团分离胚胎干细胞时表达的报道基因的延时成像来验证猜想。实验所得的关键信息是与生殖细胞特化相关的基因如fragilis和Blimp1在2i培养基里分离胚胎干细胞时是打开的，而以前报道是用饲养层和血清分离胚胎干细胞。如果不是，那么从内细胞团到胚胎干细胞的过程则不需经过原始生殖细胞。然而这些与原始生殖细胞相关的基因在含血清的饲养层分离胚胎干细胞时能被检测到，意味着是一条可以选择的获得幼稚多能性的诱导路径。为了观察非啮齿哺乳动物的幼稚多能细胞，监测这些基因的表达可能对优化胚胎干细胞分离方案、在外植体培养中最大化诱导原始生殖细胞有意义。也有可能发展将原始生殖细胞转化为胚胎干细胞的方案。最近描述在2i培养基上从大鼠胚胎分离胚胎生殖细胞的高效生产也许可以阐明如何实现这个目标。