LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册.pdf

1 Leica 激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司 2013 年 3 月 2 目录： 1 系统的组成 系统组成 .3 光路示意图 .4 2 系统的使用 2.1 开机顺序 .5 2.2 软件 界面简介 .7 2.3 在显微镜下观察样品 .8 2.4 采集共聚焦图像 .9 2.5 XYZ三维扫描（ Z-Stack） .11 2.6 时间序列扫描（ Timeseries or xyt Scan） 15 2.7 波长扫描（ xy Scan） .16 2.8 HyD检测器 .17 2.9 图像的保存及输出 .18 2.10 关机 .20 3 系统的维护 .21 3 Leica SP8 系统组成图 4 1 可见波长激光或白激光 15 UVIS, HIVIS或 VISIR的 光路 镀膜 2 声光 调制器 （ AOTF） 16 扫描 视场旋转镜 （ Abbe-Konig 旋转） * 3 红外激光（ IR） * 17 在 NND位置上的反射光检测器（ RLD） * 4 电光调制器 18 物镜 （ 可提供各种选择 ） * 5 紫外激光 * 19 在 NND位置上的透射光检测器（ TLD） * 6 AOTF或直接调制器 （ DMOD） 20 正方型针孔 7 STED 激光 * 21 Fluorifier盘 * 8 Setlight监控二极管 22 X1出口接口 * 9 AOBS, 及其他选 配 件 23 外置检测器 * 10 用于 FRAP的光束增强镜 * 24 色散棱镜 11 红外激光耦合 25 分开的荧光光谱 12 与 CS2紫外光路耦合的紫外激光 26 最多 5个光电倍增管或 4个 HyD检测器 13 STED激光耦合 *选配组件 14 全视野扫描 镜 及 串行高速 扫描 镜 选 件 5 2 系统的使用 2.1 开机顺序 （硬件标号请参考前面的系统组成图） （ 1） 因为 FSU 和 CSU 硬件的电源控制 ）不同，请分别按照如下步骤开机： FSU 系统 CSU 系统 依次打开 “ PC Microscope”、“ Scanner Power”、 “ Laser Power”三个按钮，将“ Laser Emission” 上的激光开关钥匙旋至“ On-1 注意：显微镜控制器的开关 一般是 常开 的，在打开 “ PC Microscope” 按钮后指示灯 应该点亮，如果不亮，请打开其开关。 先按电脑主机上的电源按钮启动电脑，再打 开显微镜控制器 的开关，然后 依次打开 “ Scanner Power”、“ Laser Power”两 个按钮， 将“ Laser Emission”上的激光开关钥匙旋至 “ On-1 之后 两个系统 的操作一样 （ 2） 打开荧光激发光源 （按绿色的 Power 按钮，如右图） 光源亮度调节旋钮 光闸 Power 按钮 6 （ 3） 电脑进入操作系统界面后 ， 双击电脑桌面“ LAS AF”图标启 动共聚焦操作软件。 （ 4 ） 进 入 配 置 选 择 界 面 后 ， 在 “ Configuration”下拉菜单中选择需要的 配置 ； （其中带有“ simulator”字样的为模 拟方式，该方式不控制显微镜硬件，不能 拍摄图像，适合处理数据） “ Microscope” 菜单中选择显微镜型号； （图中 “ Resonant” 选项 为快扫功能，可按需要 打开或关闭 ， 只有配备了快扫功能的系统才会显示该 选项） ，点击“ OK” ，系统继续启动。 （ 5） 在“ Initialize Stage”提示界面选择是 否初始化载物台 （ 如果选择“ No”，则 Tile scan、 Mark&Find 和 Matrix 功能不能使用 ） 。 注意：如果配置的是手动载物台，则不 会跳出该提示界面。 （ 6） 系统自检完后，进入 LAS AF 操作界面 ， 点击界面最上方“ Configuration”按钮进入配置界面点击左边“ Laser Config” 按钮打开所需激光 （ OFF ON） ， Argon 激光还需拖动右方滑块以调节激光输出 功率 7 2.2 软件界面简介 功能界面切换：参数设定（ Configration）、扫描取图（ Acquire）、图像处理（ Process）、 定量测量（ Quantify） 工具和文件管理界面切换： Experiments 界面下显示当前拍摄和打开的图片， Acquisition 下显示的是当前功能界面的功能按钮和参数 拍摄参数：包括图像 像素 Format、扫描速度 speed、图像放大 Zoom factor、视野旋转 Rotation 等 。 三维扫描工具组 ，用于设定和显示三维扫描的 Z 轴范围，及其他辅助设定 光路 显示及 设置区域 ，从上向下直观显示了从激发到荧光检测的光路细节和关键设置 图像显示窗口 预设光路选择按钮 激光控制栏 分光镜 选择按钮 物镜选择按钮 预览按钮 ，可用于开始和停止预览 拍摄 图像按钮 叠加图像显示按钮 ，在使用两个或以上数量通道拍摄多色图像时，用于显示所有通 道叠加后的图像 界面缩放调节滑块 ， 左右拖动可以调节界面项目的显示比例 界面调整 栏，左右拖动可调整光路设置区域与图形显示窗口的范围 8 2.3 在显微镜下观察样品 2.3.1 选择 物镜 ： 可通过显微镜主机 右侧 的物镜转换按钮，或软件中的“ Objectives” 按钮 进行选择 （如下图） 。（ 在 显微镜设置软件 Leica AF Hardware Configurator 中可设定最下方的 红圈中的 按钮为干 /油镜转换 ，在 干 /油镜 之间切换时需要先按 一下此按钮才能完成转换 ） 2.3.2 明场观察： 将样品置于载物台上，按显微 镜 左侧 的 TL/IL 按钮打开明场光路 （如右图） （因 显微镜所处状态不同，有时候需要按两次才能 打开）， 在明场条件下选择合适的视野。通过 调焦按钮或旋钮调节至合适的 z 轴平面，通过 显微镜主机左侧的“ INT”功能键调节光强。 如果是电动载物台，需通过遥控手轮调节 载物台的运动以选择合适的视野（如下图）。 2.3.3 按显微镜前面板的荧光 滤块 选择按 钮切换至荧光观察光路（如右图所示 ） ， 其 上的 标注 与荧光颜色的对应关系为： I3 - 绿色， N2.1-红色， A蓝色， 有些配置的 显微镜按钮对应的荧光颜色可能会有所不 同，请以实际情况为准 。 再按荧光光闸按钮（ SHUTTER）打开 荧光，进行样品的荧光观察。 2.3.4 观察完毕后，按显微镜前面板上的 9 “ SHUTTER”按钮以保护样品 2.4 采集共聚焦图像 2.4.1 光路 设置： 调用已有的设置：选择“ Load/Save single setting”下拉菜单中已有的设置 ， 激光 波长 及 其输出功率、分光镜、检测波长范围、 检测器 gain 及 offset 都会自动设置 ， 包含几种最 常用 的荧光染料。选择某一设置后，可按样品的实 际情况对参数进 行优化 （ 如后述 ） ，并以新的 名称保存。 （如右图） 修改已有设置：可改变所选激光、调节激 光输出功率、改变分光镜、改变所选 PMT、调 节 PMT 检测范围、 调节 PMT 的 gain 或 offset 等。如 下 图 。 建立新的设置：也可从零开始建立新的设置。选择所需激光及其功率、 适宜的分光镜、 检测器 及检 测波长范围。 10 分光镜选择原则： 根据所用激光 波长来选择合适的分光镜。 1 405 激光选择 Substrate； 2 其 他可见波长的激光 根据其波长 选择 分 光镜，如 488 激光可选择 DD488/552、 TD488/552/638 分光镜。 3 RT 15/85 分 光镜所有波长激光都可用，但是会损 失 85%的激光能量和 15%的荧光能量，一般在 当现有分光镜无法满足当前激 光谱线组合或 进行光谱扫描的时候选用。 Sequential Scan:若染料的发 射光谱有重叠， 为减少串色， 成像 时每种染料要单独激发，或者说， 每次只用一种激发光激发，并只检 测一种染料。可用 Sequential Scan 来实现。 （如右图）激活 Sequential Scan 功能，可在下面的 Seq 中分别 设置各个染料的激发和检测光路。 2.4.2 选择扫描模式 默认模式为 xyz 扫描，是最常 用的扫描模式，可用于 xy 扫描和 z 轴层切 （ xyz 扫描 ） 。还可在下拉 菜单中选择由 x， y， z， t （ 时间 ） 以及 （ 波长 ） 组合而成的多维扫 描模式， 如 xzy， xyt， xy， xyzt， xyz， xyzt 等 。 2.4.3 设置扫描参数 包括分辨率 （ format） 、扫描速 度 （ speed） 、针孔大小 （ pinhole） 、 线平均 （ line average） 、面平均 （ frame average） 、累加 （ accumulation） 及放大倍数 （ Zoom） 等 。 （如右图） 分辨率：默认值为 512 512。也可选择更低或更高分辨率。分辨率越 高，所获取的图像文件越大，采图所需时间也越长。 扫描速度：默认值为 400Hz。活细胞或运动的样品成像可能需要更快的 速度。可选择双向扫描 （ Bidirectional X） 来达到更高速度，这时可能需要 进行相位校准 （ Phase correction） 。 针孔大小：默认值为 1AU。 如果增大针孔直径，可 增加信号强度， 但是 所获取图像的 共聚焦效果会降低， 光切厚度也会随之增加。 平均：用于降低背景噪音。分为线平均 （ Line average） 和面平均 （ Frame average） ， 可在下拉菜单中选择平均的次数。 11 累加：仅用于荧光非常弱的样品 2.4.4 预览图像 点击 软件 Acquire 界面左下方的 “ Live” 按钮 以预览图像 （下图） ，图像 将显示在右侧的显示屏上 。 预览开始后，“ Live”按钮变为“ Stop”， 点击“ Stop” 按钮 可停止预览。 注意： 一旦预览开始，激光开始照射样品，为减少对样品的伤害，应 快速操作，尽量减少预览的时间。 建议：点击 Live 按钮之前，可调节 format 至 512 512， speed 至 600Hz 以获得较快的刷新频率。 预览应达到以下目的： 1 找到最适合观察的焦平面； 2 使图像亮度动 态范围达到最佳 。 可通过调节控制面板的“ Z Position”旋钮找到最适合观察 的 焦平面（如 下图）； 或者调节遥控手轮或显微镜镜体上的调焦旋钮 （见第 8 页图） 。 图像亮度动态范围可通过调节激光输出功率（见第 9 页图）、 Smart Gain 和 Smart Offset（见上图）。 参数的调整原则： （ 1） Smart Gain 的调节： 增大则信号和噪音都增强，减小则信号和噪音均减小。 一般情况下， Gain 值的正常范围为 5001000； （ 2） Smart Offset 的调节： 可扣除背景噪音，但标本信号也有一定程度的扣除。 原则上，在保证图像质量的前提下， Digital Offset 值越接近于 0 越好 ； （ 3）另外，对于每个通道，需要灵活调节激光的强度： 激光强度越高，则信号 越强，同时标本更容易被漂白或淬灭。 当 PMT gain 值高于 800 或 HyD gain 值大 于 100%时荧光图片亮度还是不够时，可以考虑适当增加激光强度 。 在做活细胞 或者光切时，应尽量减少激光强度 ， 原则上，在保证图像质量的前提下，激光强 度越低越好 。 12 图像亮度动态范围的判断方法 ： 理想的荧光图像中应该只有少数像素点达到饱和 ， 可通过位于图像左侧的 LUT按钮进行观察。 LUT 按钮 （下图红圈） 可在 LUT （ 即指定的荧光颜色，也称 伪彩 ） 、“ Glow Over Under （ GlowOU） ”和 灰度图 三档之间切换。在 GlowOU 模 式中，灰度值 达到饱和 的像素点显示为蓝色，而灰度值为 0的像素点显示为绿色。 调节 Smart Gain使图像中仅少数像素点呈蓝色， 调节 Smart Offset来降低图像的背 景。荧光图像 Smart Offset的默认值为 0%，通常应将其调为负值以使图像背景呈 绿色。 下 图 中 B图 亮度及背景值设置均未达最优化值，调节 Smart Gain和 Smart Offset后，达到 C图 中的效果，部分信号呈蓝色，而背景呈绿色。 对于 HyD检测器，其背景噪声很低，无需通过 调节 Smart Gain来降低背景。 对透射光图像，同样可以调节透射光 PMT 的电压和偏移值来进行优化，有 时可将 Smart Offset调至高于 0%以增加对比度。 如果启用了 Sequential Scan，在应该在每个 扫描序列（ Seq） 分别 通过预览来 调整图像亮度。 2.4.5 采集图像 对于单通道染色，或多通道染色同时扫描，单击“ Capture Image” 按钮 采集 图像。对于序列扫描，或多维图像扫描，单击” Start” 按钮 进行图像采集。 （ 见 下 图） 在此之前可改变扫描分辨率、线 /面平均次数等扫描参数。 扫描分辨率的设置原则： 通常情况下，采集图像时，为充分利用物镜的分辨能力， 可直接点击 “ Optimize xy Format”按钮（如下图），由系统自动设置最佳分辨率。 13 根据 Nyquist 采样原则，像素点大小 （ Pixel Size） 应为物镜侧向分辨率 （ 即 xy 平面分辨率 ） 的 2/51/2。物镜分辨率可 点击物镜参数表按钮从弹出的 界面读 取 ， 像素点大小可在采图参数设置界面获得。像素点随扫描分辨率增大和放大倍 数 （ zoom） 增加而减小。 与高倍物镜相比，低倍物镜需要更高的扫描分辨率 。 2.5 XYZ三维扫描（ Z-Stack） xyz 扫描模式为默认采图模式 ，加上 Z轴扫描多个层面， 适合观察样品中目标的空间分布。 现有的 LAS AF软件 3.0和 3.1版本 Z-Stack的设置界面不同 （如下图所示），但是基本采图流程类似。 2.5.1选择 Z轴驱动方式 根据不同的系统配置，可以点击 Z轴驱动方式按钮 选择“ z-Galvo”或者 “ z-Wide” 方式： “ z-Wide” ：使用显微镜固有的 Z轴调节方式，倒置显微镜调节物镜的升降， 正置显微镜调节载物台的升降 ，可通过显微镜镜体的调焦旋钮和遥控手轮的调焦 旋钮控制。 “ z-Galvo”：使 用 选配的 SuperZ进行 精细的 Z轴调节，只能通过控制面板的“ Z Position”旋钮控制。 2.5.2 设置 光路 参数 ，方法同前。 2.5.3 设置 Z轴范围 点击“ Live”进行图像预览 ， 调节 z 轴至层切所需的起点，点击扫描起始设 置按钮 定义层切起点 ， 调节 z 轴至层切所需的终点， 点击扫描结束设置按钮定义 14 层切终 点 ， 点击“ Stop”终止图像预览。 2.5.4 Z轴参数调整 此时 xyz 层切菜单中显示的“ z-step size” （ 相邻两个光切面的间距 ） 和“ Nr. of steps”（ 层切数目 ） 为系统的优化值 （ “ system optimized” ） 。也可点击“ Nr. of steps” 左侧的按钮，然后对相邻光切面间距或层切数目进行自定义。 2.5.4 采图 选择合适的分辨率和扫描线速度，点击” Start”进行 xyz 图像的采集。 采图完毕后， 3.1版本的 点击 清除已设位置按钮， 3.0版本的分别点击扫描起 始和结束位置设置按钮，使其变为灰 色， 使 Z轴位置 重新处于未定义状态 ，以免 影响下次采图 。 2.5.5 3D展示 拍摄完 3D图像之后，在图像显示窗口右侧会多出 3个用于 3D图像显示的按钮： 最大亮度投影按钮（ Maximum projection） : 将所有 Z平面的图像信息选取最 亮的 点集中 显示在一层，相当于将多层图像压成一层，多用于集中显示跨越多个 层面的结构信息。 正交剖面方式按钮（ Orthogonal section） : 分别以 XY、 YZ、 XZ三个方向显示 指定位置的剖面 信息，如下图 ，多用于观察结构在 3D空间内的定位。 3D立体模式按钮（ Open in 3D viewer） : 打开 3D可视化模块， 以直观 方式展 15 示 3D结构，如下图，该模块功能强大，有多种参数可以调整显示方式，亦可以 将所观察到的图像输出成视频。 2.6 时间序列扫描（ Timeseries or xyt Scan） 时间序列扫描多用于活细胞成像，记录动态过 程。 2.6.1 在“ Acquire”菜单栏的“ Acquisition”中 选择 xyt 扫描模式后，将出现 xyt 扫描菜单，如 右图 。 2.6.2 设置 光路 参数，方法同前。 2.6.3 定义“ Time Interval”，即采集相邻两帧图 像所需的时间间隔，也可选择最小值“ Minimize”。 2.6.4 按采图需要选择“ Acquire until stopped”、 “ Duration”或“ Frames”。 若选择“ Acquire until stopped”，则图像将持续 采集，直至手动终止。 若选择“ Duration”，可定义采图所需的总时间。 若选择“ Frames”，可定义所需的图像帧数。 2.6.5 选择合适的分辨率和扫描线速度，点击 “ Start”进行时间 序列图像的采集。 16 2.7 波长 扫描（ xy Scan） 波长扫描常用于自发荧光或新染料发射 光谱的检测 ，如果有串色严重的标本需要进行“ Spectrum Dye Seperation”，必须 进行波长扫描 。 2.7.1 在“ Acquire”菜单栏的“ Acquisition”中选择 xy 扫描模式后，将 出现波长扫描菜单， 同时检测通道变为如下方式： 2.7.2 选择 合适的激发光和分光镜 。 2.7.3 定义“ Detection Begin” （ 需检测的发射谱起点 ） 和“ Detection End” （ 需检测的发射谱终点 ） 。起点所在波长应大于激发波长。 2.7.4 定义“ Detection Band Width” （ 接收的带宽 ） ，通常为 10nm。 如果图 像较暗，可以增加带宽，但是光谱数据的精度会降低。 2.7.5 定义“ No. of Detection steps”（ 采集的帧数 ） 或“ -Detection Stepsize” （ 波长步进 ） 。波长步进不应大于接收带宽。 2.7.6 选择所用 PMT检测器（或 HyD检测器） 。 2.7.7 选择合适的分辨率和扫描速度，点击“ Start”进行 发射 波长图像的 采集。 2.7.8 扫描结束后，可保存发射光谱信息。操作路径为： 17 “ Quantify Tools Stack Profile” ，如下图： 在图像窗口的右下角，拖动波长滑块，显示的图像会随之变化，选取有典 型结构的一张； 在图像窗口上方选项画图工具，圈一个典型区域，中间的 Graphs窗口即显示 出该区域的发射光亮度随波长变化的曲线 （上图中的绿色曲线） ； 在上图所示位置点击鼠标右键，弹出的选项中有一个“ Export to Dye Data Base”的选项，点击，弹出命名新染料的对话框； 输入染料名称、激发波长（最大发射波长系统会自动计算出，也可以自己修 改）、备注信息等，点击“ OK”，新染料数据即被存入系统的染料数据库。 可以通过“ Configuration/Dye Database”去查看，加入数据库的染料可用 于 以后采图的参考。 2.8 HyD检测器 HyD检测器 是高性能的检测器，比 PMT更灵敏响应速度更快， 并且有更多的功能。 HyD检测器有三种操作模式可供选择： Standard：标准模式， 跟 PMT一样，检测到的信号直接显示 为图像，可通过调节 SmartGain来调节图像亮度。 Counting：光子计数模式，以每个像素点所检测到的光子数 显示为该像素点的亮度，此时检测器的 Gain为一个定值， 通过长 时间的检测使图像显现出来。常用于非常弱的荧光样本的成像。 使用此模式采图时，需使用 累加 （ accumulation）功能来使采集 到的图像达到合适的亮度。 BrightR： 如果 视野 中有非常亮的结构，但是又需要 将 较暗的结构显示出来时， 18 适合用此模式，此模式会在较为暗 的部分使用稍多一些的动态范围， 如 右 图。 注意： HyD检测器非常灵敏， 如果收集到过强的光信号会影响 其寿命，系统有一个安全机制对此 进行保护，如果信号过强，会先有 声音报警，如果操作者未采取措施， 会自动关闭检测器，同时弹出如下 的提示窗口： 此时应点击“ Stop”停止预览，降低激光功率，调低 SmartGain值，重新预 览。 特别注意 ： 1 使用 HyD成像时，一开始激光功率 不要 设置太高，应从低开始慢慢增加； 2 不要 用 HyD检测反射光，因为一般情况下，反射光亮度要大大强于荧光。 2.9 图像文件的保存及输出 2.9.1图像文件的操作： “ Acquire”的” Experiment”下显示采集的所有图像文件名称， 默认本次开 机后采集的所有图像都放在一个文件夹下， 右键点击文件名，可进行多种操作。 如 下 图 ： 19 选择“ Save Experiment”即可将当前文件夹下的所有图片保存为一个文件， 文件保存格式为 *.lif 原始文件，只能通过 Leica LAS AF、 LAS AF Lite 或其他专业图 像数据处理 软件打开 。 2.9.2图像文件的输出 ： 右键点击图像文件名，选 择 ”Export”进行图像输出，可输出成 图片 （ .tiff 或 .jpeg） ，三维或多维图 像还可输出成电影 （ QuickTime、 .avi、 MPEG-4、 WMV等 ） 。如 右 图 。所得 文件可用普通 图像浏览软件打开。 选择” As Tiff”或” As JPEG”，出现如 下 图的对话框，可选择输出路径、所 需标尺及位置等。确定后，点击” OK”，即可将图像输出至指定路径。 20 2.9.3图像采集参数的观察及恢复 ： 右键点击图像文件名，选择” Properties of”，即显示该图像采集时的所有 参数设置信息，如图 8-5。 点击” Apply Settings”，即可恢复该图像采集时的参数设置。点击” Save as.”， 可将所有参数信息输出成 .xml文件并存至指定路径。 2.10 关机 （ 1） 保存已采集的图像。 （ 2） 在 LAS AF软件 Configuration”“ Laser Config” 界面关闭所有激光。 （ 3） 关闭显微镜荧光电源。 （ 4） 若使用过油镜，需用无水乙醚与无水乙醇混合液 （ 体积比 7： 3） 或无 水乙醇清洁镜头。 （ 5） 关闭 LAS AF 软件。 （ 6） 将电脑桌右侧“ Laser Power”按钮右侧的激光开关钥匙 （ Laser Emission） 逆时针旋转 90度至“ On-0”位置。 （ 7） 关闭“ Scanner Power”按钮。 （ 8） 在电脑上进行图像数据的输出。 （ 9） 关闭电脑后，关闭“ PC Microscope”按钮（ CSU系统需关闭显微镜控 制器开关）。 21 （ 10） 风扇停止后 （ 关闭激光开关钥匙约 5分钟后 ） ，关闭“ Laser Power” 按钮。 （ CSU系统可直接关闭 “ Laser Power”按钮 ，无需等待风扇停止）。 记录关 机时间、仪器状况等信息。 3 系统的维护 （ 1） 保持室温为 18-25 ，相对湿度 40-60%，尽量保证室内环境的清洁。 （ 2） 严格遵守激光器的开、关流程。 （ 3） 如荧光光源为汞灯，则打开电源后 需等 10-15min方可使用；如荧光光 源为金属卤素灯，则打开电源后可直接使用。无论哪种灯作为光源，打开后 20min 以上才能关闭。 （ 4） 如需用到“ Mark and Find”、“ Tile Scan”、“ Matrix”等要求载物台精确 定位的功能时，在启动软件后选择进行载物台初始化，否则也可不做初始化。在 初始化过程中，载物台会向四周运动，因此需保证周围没有物品阻碍其运动。 （ 5） 若使用过油镜，需用蘸有无水乙醇的擦镜纸清洁此物镜；若使用过水 镜，也需用干擦镜纸轻轻吸干上面的水渍。 （ 6） 关机前，尽量将当前物镜转换为低倍物镜并调至最低位，可最大程度 保护物镜。 （ 7） 输出数据时，使用光盘刻录数据而非移动存储设备可更好的防止电脑 中毒。 （ 8） 避免空调直接对着显微镜吹风。 （ 9） 拍摄图像时，应避免震动、环境光线、手机信号等的干扰。 如欲了解 LEICA SP8的更多详细应用， 可按在软件界面按“ F1”键， 点击界面上出现的“？”圆形按钮打开帮助系统 。 也可 浏览以下网站 ： http:/www.leica-