得到发光大肠杆菌的实验设计

得到发光大肠杆菌的实验设计20 艾珉吉PEGFP-N3载体为真核细胞表达载体。主要有以下几个部分载体质粒PET-28a目的基因质粒（绿色荧光蛋白）质粒重组 PET-28a-GFP将重组质粒导入大肠杆菌体内检测目的基因是否表达成功一、实验所用质粒PEGFP-N3质粒编码野生型GFP的红移（荧光波长较大）变异体蛋白，具有更强 的荧光（在485nm激发下比野生型强35倍）和在哺乳动物细胞中有较好的表达。 激发峰在488nm，发射峰在507nmpET-28a 质粒载体上面携带一个 N-terminal His Tag / Thrombin /T7 tag 结 构以及一个可以选择的C-terminal HisTag。克隆表达区域的编码框由T7RNA聚合酶转录。二、具体步骤（一）重组质粒PET-28a-GFP的构建先获取大量的目的基因，然后构建重组质粒，进而导入大肠杆菌通过对 大肠杆菌的培养繁殖来让质粒扩增，以获取更多的质粒具体操作；PCR、酶切等方法获取目的基因，酶切连接重组质粒PCR实验用品：1材料：pEGFP-N3质粒，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套。2试剂：ddH20、lOxBuffer、MgCl2、4xdNTP、弓|物、Taq酶、 质粒DNA模板、琼脂糖、Gold view。3.设备：移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统。注：绿色荧光蛋白引物：pl Ndel/p2 Xhol正向引物-pl : 5-ggg cat atg gtg agc aag ggc gag gag-3反向引物-p2 : 5-ggg etc gag tta ett gta cag etc gtc catg-3PCR实验步骤：1. 在0.2mL EP管内配制5OpL PCR反应体系1个:ddH2O 34pL、 10xBuffer 5pL、MgCl2 3pL、4xdNTP 2pL、正向引物 1pL、反向引 物1pL、Taq酶1pL、质粒DNA模板3pL。2. 混合后瞬时离心。3放入PCR仪中，设置反应程序： 94C预变性5min ; 94C变形30s ; 55C退火30s ; 72C延伸60s ; 重复步骤30次； 72C 延伸 10min。4取5pL反应液加1pL 10xloading Buffer做电泳检测，分析所得目的 片段的大小。DNA连接实验用品：1材料：酶切后的EGFP、pET-28a , 0.2mlEP管，取液器吸头，一 次性手套。2试剂：T4DNA 连接酶，ddH2O , T4DNA 连接酶 buffer。3设备：移液器，台式高速离心机，PCR仪。DNA连接实验步骤：1. 在0.2mlEP管中配置下列体系：10xbuffer 2.5pL、酶切后的 pET-28a7.5pL、酶切后的EGFP（绿色荧光基因片段）13pL、T4DNA 连接酶（考虑连接效率）2pL、X:Y=1:1030,总体积25pL。2. EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱22C反应20min , -20C 下保存用于转化实验。重组质粒转入DH5a扩增，菌落PCR鉴定阳性克隆：（二）、质粒的提取和凝胶电泳的检测 电泳：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分 子。DNA的迁移率（U ）的对数与凝胶浓度（T ）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常 重要的。在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开 环DNA、闭环超螺旋DNA。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA泳动速度:闭环超螺旋线状 开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度 及核酸染料含量有关。试剂:1、质粒快速提取试剂盒溶液 1（ SET 缓冲液）、溶液 2（ Lysis Buffer）、溶液 3（ 3M NaAc,Ph4.8）、结合缓冲液、漂洗液、洗脱缓冲液、吸附柱、废液收集管2、电泳检测TAE缓冲液、琼脂糖、Loading buffer、EB仪器、耗材：台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、移液器、1.5ml Eppendorf管 操作步骤：培养细菌:大肠杆菌接种到LB培养基2ml-5mI中,37度振荡培养8-16小时.（2）收集菌体：取培养液1.5ml于Eppendorf管中,12000rpm离心3分钟，去掉 上清液.裂解：加入100ul溶液1 （用完后4度保存），充分吹打混匀后，加入150ul 溶液2用完立即拧紧瓶盖)温和颠倒5-10次，零下20度放置3分钟加入150ul 溶液3,温和颠倒5-10次，放置5分钟.12000rpm离心5分钟(4)收集质粒：取吸附柱，加入 420ul 结合缓冲液，取离心后的上清液到吸附柱 中(不要吸到蛋白沉淀)，混匀.12000rpm离心30秒，弃去废液.吸附柱装回收 集管。向吸附柱加入700ul漂洗液，12000rpm离心30秒。倒掉废液，装回吸附 柱。重复(5),再次12000rpm离心2分钟以完全去除漂洗液。(7) 回收质粒：将吸附柱移到一个新的1.5ml eppendorf管中，向吸附膜中央加 入 50ul 洗脱缓冲液2水浴预热至 70 度) ，溶解提取物,室温放置 2 分钟， 12000rpm离心2分钟.(8) 琼脂糖凝胶电泳检测提取结果.重组质粒的构建（三）、目的基因片段的酶切原理：DNA限制性内切酶是生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一 种内切核酸酶。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切 酶（简称限制酶）。Bam H I切割识别序列后产生的粘性末端：5GJGATCC 3 5GGATCG33CCTAGTG 5 3CCTAGG5Not I切割识别序列后产生的粘性末端：5-GC!GGCCGC-35-GCGGCCGC33-CGCCGGTCG-53-CGCCGGCG-5实验用品1材料：提取的质粒PEGFP-N3和pET-28a ,0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套2试剂:Not I, Bam HI, ddH2Q双蒸水保证杂质基本去除防止DNA降解）, lOxbuffer （目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件），琼脂糖， Gold view （可代替溴化乙锭的新型核酸染料，GoldView与核酸结合后能产 生很强的荧光信号，在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光）3 设备：移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温培养 箱实验步骤1、分别取两支0.2mlEP管做上记号：如2、两个EP管中分别配置下列的30 pL体系： EP管EP管BSA 3 pL BSA 3 pL10xbuffer 3 pL 10xbuffer 3 pLNotl 2pLNotI 2pLBam H I 2pLBam H I 2pLpET-28a 20 pL pEGFP-N3 20 pL3、将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱370C酶切3h。4、取5pLEP管的酶切反应液，同时取5pL原质粒溶液作对照，进行电 泳检测酶切结果。5、按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段 （四）目的基因片段和载体的扩增(1) PCR-聚合酶链式反应:1、将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分PCR反应体系 各成分的量 template 0.1 ul P1(20 mM)0.2 ul P2(20 mM)0.2 ul dNTPs(10 mM) 0.4 ul Taqs(5 U/l)0.2 ul 10xPCR buffer2 ul ddH2O16.9 ul Total20 ul2、将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。预变性95 C 3 min , 变性95 C 30 s,退火60-55 C 30 s,延伸72 C 1 min 10个循环，每个 循环降0.5 C。变性95 C 30 s,退火55 C 30 s,延伸72 C 1 min 20个 循环，72 C延伸2 min。3、PCR扩增完毕后，取出PCR管放在冰盒上。4取8 ul扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。(2) 琼脂糖凝胶电泳检测1、称取0.8 g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100 mL 1xTAE缓冲液，置微波 炉或水浴加热至完全融化，冷却至60 C左右。2、轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中,静置冷却30分钟以上。3、将胶板除去封胶带,加电泳缓冲液至电泳槽中,加液量要使液面没过胶面1-1.5 毫米， 轻轻拔除梳子。4、取5pLEP管的酶切反应液，同时取5pL原质粒溶液作对照分别加入 样孔中。5、接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U = 100 V, 1=30 mA。6、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2 cm处，停止电泳。7、在凝胶成像分析系统中观察结果。8、按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段（五）、DNA的连接重组（1）实验原理：连接的DNA分子具备的条件具有相同粘性末端（同种酶切的片段）勺DNA 分子比较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一个 相对稳定的结构。连接反应温度：理论上讲，连接反应的最佳温度是370C，此时连接酶的活 性最高。但370C粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们找到了一 个最适温度，即12160C，连接过夜。但现在公司提供的连接酶只需要220C 连接20分钟即可。（2）实验用品1材料：酶切后的质粒pET-28a，酶切后的目的基因片段，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套2 试剂：T4DNA 连接酶,ddH2O，T4DNA 连接酶 buffer3设备：移液器，台式高速离心机，PCR仪3）实验步骤1在0.2mlEP管中配置下列的体系：0.2ml EP 管lOxbuffer 2 pLT4DNA 连接酶 0.5pL酶切后的GFP片段9.5 pL酶切后的pET-28a质粒8pL2、液体混匀后置于1.5ml离心管中瞬时离心，放入培养箱220C温育20min 后，-200C下保存用于转化。（六）、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化重组质粒转入DH5a扩增实验步骤：1取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，5pL pET-28a-EGFP质粒加入200pL解冻的感受态细胞中，轻弹混匀后冰浴30min。2.42C热冲击90秒，立即置于冰浴5min。3在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB液体培养基于37C摇床中培养lh。4.1h后，6000r/min离心5min，去掉部分上清（约留200pL的培养液），移液 器吹打混匀菌液，再加入200pL的24mg/ml IPTG混匀。5移液器吸取混匀溶液于含Kana的LB固体培养基上，用玻璃涂布器将其均匀涂布，正置培养皿半小时后，37C培养箱中倒置培养皿过夜。6. 下次实验室观察结果。（七）、 扩大培养 培养导入重组质粒的大肠杆菌(八) 、GFP蛋白的诱导表达1目的蛋白的表达(1) 含外源基因的表达菌株在LB培养基(含50pg/ml Kana )中预培养过夜(2) 按1/50的比例稀释菌液，于250r/min，培养3小时，使其OD6OO值达到 0.6(3) 加入IPTG，使其终浓度为O.5mmol/L(4) 继续培养小时(5) 取1.5ml菌液于10000r/min，离心2min，收获菌体2目的蛋白的检测(1)凝胶制备分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分离胶，将分离胶注入 玻板后，用去离子水封口，约 3040min 后凝聚。将胶面的水吸干后灌注浓缩 胶，并插入梳子，胶凝固后即可。(2)凝胶电泳取80 ml 电极缓冲液稀释5倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。80V恒压20分钟，120V恒压2 小时(3) 染色、脱色电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色 0.51 小时；之后，在脱色液中脱色 1小时，观察目的蛋白表达情况。背景知识：1、载体特点 从结构上看，亥质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟 随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一； 含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖 的细胞中稳定表达； 具有多克隆位点，更于目的基因的插入； 该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶 细胞。这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。PEGFP-N3载体上携带有EGFP蛋白表达基因。2、GFP 的相关知识绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein , GFP)基因由238个氨基酸组 成，分子量约为27Kd。GFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都 很稳定，用甲醛固定后会持续发出荧光，但在还原环境下荧光会很快熄灭。与以往常用的报告基因相比，GFP具有以下优点： 在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色 荧光，直接、简捷、更于检测； 无需任何的作用底物或共作用物，检测的灵敏度不受反应效率的影响，保 证了极高的检出率； 蛋白本身性质稳定； 可在多种异源生物中表达且无细胞毒性； 其基因片段长度较小(约717 bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能 保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。EGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大 大增强了其报告基因的敏感度。EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例 子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光。3、重组 DNA 分子的转化原理：细菌处于易吸收外源 DNA 的生理状态叫 感受态，转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过 程。其原理是细菌处于0C在有CaCl2存在的低渗溶液中菌细胞膨胀成球形。 转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养 基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达。在选择性培养 基上进行重组子的鉴定。