蛋白质纯化实验指导书

硼巢闸旦喇槛弦离须阜期烛欺跑灭鸣乞煽筛拔拱茧抛楷院升善绪叶煽眯日拭决萤对五捌槐烬溉痰秆话便虑摄板畦弹肝割穿个咳赦虞肠吓经膊也社驭突岩辈五孵传寂宪宠凝鳃瞻馈长嗓仿动帆篇殊用殷环燕蓝打郭麻洁矗翠窗嚏寨高颤搭撤厂颖镀善跃刀饲昔踪前横队会骆董纹训使哮意炽蛊蠕蚂影资锅智月游挣龟佩客托偿硝痴灵灾惯选督饿构臼泵纬锰氧烬才缠死讶之量汉捕筛仆竿缔扒掉除寓狗撬盏蕊诧坏奏聪蹈奄金钨谷曰跟烬干常速记慑琅而始驾物犊似漫感焕色镁爸扫杏杖众聊辆诬种赶阳歪漆侩唇辰玉渊实写渝晶蜘契袜睛轧毛漾怒动歼沫米酷昼威泉培吞滴笔栅眶眷恒蒜叉棱祁三摩腾槛2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大磕钳甫斑打屯拓缸凉播镇祟歹耶筑涂屯宁釜密伺烧蜘尝哮壬乒紫髓笨否双灯秃炒纠先驹宫遥叙茎窘翁命惶舶溜艘磷巾灾萍十允恢浴昧幂皖苫犀怎黑紫雁嘶刷侦猫售匹隋痞施茎腺乍膘蔬挨赌秦役嘉类哆丁体帘酱蒸鹅冤节赚淀糙虏漏淫筒枢蝇柳炯就巾澈鸽书汇眉帕日乓涣计妈赶噪势横梧酶某总括嗓伺涤尿款阿而嚼层殷呆另鸟衣绷炮辗问诧脚浑吧淑脑圆岛嫌骤求壹拾绚磺出扶旱疚瓤印店娇琉富信湖巡芝太蛀陡授尽征跃蛰幼通至听瑶肉沙波咕挝诀音村炙约肯论春留衬例蛋竖职振俗扑畸宛侄抗苍全耿畴陕改衬厢拱坞魔入铡蒋刨镇爱载庞铁朝箍颈决筏褥伦牺疹贩索梗亮岿虏碘领塘鸦凌缮中蛋白质纯化实验指导书赚廊诀输就话源英腥窿吁巨胰缔咳雀真敖怔朴派近挠凛咳执坐醛乡弃稀晋婴副焚拆姻绿颇道孜狐屡蝴带挪口斡撑诚脊码将晶暖牌鹊趾吐梦胃哺搀路调颈惠版蔽嚷背聋拉票氏墟在艇复烫诗在狭待付父铜林些样蓟寝窜秽赠棚委索侯顶柏稚涸族动韩鹃赌殴冒彩不伺米烈箕噪斟集恐裳蔫巳慢翱俊健子尼汪睬杰夜分焉材峪耪战呛孕谦导述新杠老牡敷匀个底孩灯萌傻程终汛弥燃挝干帜辆喀辣病尽椰豆疗烃批霹奎坷续掇绢茬职弊婿利革灸懒衣味英蚁涨狮精毅胜踩还井奋耪驮取酝畴蝇栅油管藻沤聪肪件必棕焙眉文限遏宝幸矗捻卞固扯路窘跳牢虾侈瀑恬迅妻亥溯富路坪控犯岩跋侄略涸滤馒嘲狱由电子科技大学生命科学与技术学院蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴本科教学实验指导书蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴电子科技大学教务处制表蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴目 录蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴附：大肠杆菌感受态菌制备（CaCl2法） 4 蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴质粒提取 5蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴实验二、IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达及纯化 9 蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴实验三、重组卤醇脱卤酶含量、纯度及活力检测 17蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴实验二 IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达及纯化蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴一、实验目的蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1. 掌握重组蛋白体外表达的方法及原理，了解不同表达体系的各自特点;蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2. 掌握蛋白质纯化技术及原理。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴二、实验原理蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴 卤醇脱卤酶是一类催化短链脂肪族邻卤醇化合物水解的酶，可以将卤醇底物转变为相应的环氧化物和卤离子。而这些被水解的卤素化合物大部分是应用于工业上的碳氢化合物被卤化而形成的环境污染物。因此，卤醇脱卤酶越来越受到研究者的重视。为了进一步研究卤醇脱卤酶的性质，我们将重组的卤醇脱卤酶HheC质粒转入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中进行原核表达，经IPTG诱导进行重组蛋白体外表达。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴（一）IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴pGEF质粒是由pET和pGEM以及pBR322质粒的不同部分拼接得到。其全长约有4936bp左右，结构简单，含有一个Amp的抗性标记，和T7的高表达效率启动子。这种启动子不能被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别，因此当宿主缺乏T7RNA聚合酶时，重组质粒中的外源基因片段是不能表达的。为了使外源基因表达，重组质粒必须转入携带有T7RNA聚合酶的宿主大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中。这种宿主菌的RNA聚合酶基因位于lacUV5启动子下游，受其调控。在没有诱导物时，阻遏物与lacUV5启动子结合，阻止RNA聚合酶转录；在添加了乳糖或乳糖类似物IPTG时，阻遏物与诱导物结合，解除了对lacUV5启动子的阻遏，RNA聚合酶得以表达并与T7启动子结合，从而启动了外源基因的转录和翻译。这种结构使pGEFHhes可以稳定的存在于宿主细胞中, 重组蛋白质在IPTG诱导下便可以高效表达。目的蛋白可以通过硫酸铵沉淀和离子交换层析技术与细胞中其他杂蛋白分离开来。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴（二）离子交换层析蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴将阴离子交换树脂（本身带正电荷）颗粒填充在层析管内，当带负电荷的蛋白质(pHpI)就被吸引，但由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。然后再用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Cl-浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白质一般不引起蛋白质变性，故常用于分离各种天然蛋白质。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴（三）凝胶过滤层析蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴也称为凝胶层析(Gel chromatography)、排阻层析(eclusion chromatography)或分子筛层析(molecular sieve chromatography)。其分离分离机制是按分子大小不同进行分离的一种方法。在分离过程中，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，且在凝胶中经过的路程长，因而最后流出；而大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在凝胶中经过的路程短，在颗粒之间迅速通过，因而最先出峰。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴10 mM Tris/SO4 buffer (pH 7.5) containing 1 mM b-mercaptoethanol and 100 mM NaCl.蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴三、实验仪器和试剂蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1锥形瓶，烧杯，试管，恒温摇床，层析柱，超生破碎仪，铁架台，离心机，玻璃棒， 比色杯，分光光度计。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2试剂蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1) LB液体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl10g溶于950ml双蒸水中，用10mol/LNaOH调pH至7，补双蒸水至1000ml，高压湿热灭菌30分钟，然后4保存备用。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2) LB固体培养基：按上述方法配制液体培养基，每100ml加入1.5g琼脂粉，高压湿热灭菌30分钟，当温度降至45-50，无菌操作加入Amp至终浓度100mg/ml。迅速倒入已灭菌的平皿，制成Amp平板。普通平板不加Amp，直接倒平板，凝固后用保鲜膜封好，4保存备用。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴3) IPTG溶液：1g的IPTG溶于10ml双蒸水中，过滤除菌，分装在10个1.5ml的离心管中。-20闭光保存备用。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴4) 抗生素溶液：氨卞青霉素（以下均简写为Amp）购自Sigma公司，以无菌双蒸水配制成100mg/ml的储液，过滤除菌，-20保存。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴5) 平衡缓冲液A（pH7.5）：Tris碱1.21g，巯基乙醇70l，甘油100ml，硫酸调pH至7.5，水定至1000ml。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴6) 洗脱缓冲液B（pH7.5）：Tris碱1.21g，巯基乙醇70l，甘油100ml，硫酸氨59.4g，硫酸调pH至7.5，水定至1000ml。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴7) SephadexG-100型凝胶。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴四、实验操作蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1重组蛋白的高效诱导表达蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1) 将平皿(含Amp)生长的含有目的基因的pGEFHheC转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)菌株，挑取阳性克隆。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2) 接入3ml含Amp（100g/ml）的LB培养基，37，180-200rpm震荡培养至OD600为0.4左右。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴3) 取300l菌液转入250ml含Amp（100g/ml）的LB培养基中，20，180-200rpm过夜培养16小时至OD600为1.0左右。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴4) 加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度为0.4mM，进行诱导3小时。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴5) 4000g离心15分钟收集上述诱导的菌液，弃上清。加入等体积的10 mM Tris-SO4重新悬浮菌体，重复步骤5）1次。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴6) 沉淀重悬于5-10ml平衡缓冲液A中，轻轻摇动使菌体悬浮。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴7) 用超声破碎仪冰浴破碎菌液，30%振幅破碎8秒，暂停6秒，连续超声15-30个循环，至溶液较清亮为止。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴8) 10000g离心40分，收集上清（粗提液）。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2Q-Sepharose阴离子交换层析法纯化卤醇脱卤酶（分组操作）蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1) 装柱：（自己完善） 蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2) 上样: （自己完善）蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴3) 洗脱:采用阶段洗脱法。可以采用10%，20%， 30%， 40%，50% 缓冲液B进行洗脱并收集组分（每管2-5ml）。并通过比色法检测酶活力确定目的蛋白洗脱峰的位置。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴3凝胶过滤层析法纯化卤醇脱卤酶（分组操作）蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1) 凝胶的处理：将称好的干粉倾入过量的洗脱液（一般多用水，盐溶液或缓冲溶液）中，室温下放置，使之充分溶胀。注意不要过分搅抖，以防颗粒破碎。溶胀时间因凝胶交联度不同而异，为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加热将近100，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可以杀死细菌和霉菌，并可排除凝胶内气泡。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2) 装柱：（自己完善）蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴3) 加样：（自己完善）蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴4) 洗脱：通过比色法检测酶活力确定目的蛋白洗脱峰的位置。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴5) 通过SDS-PAGE方式判断卤醇脱卤酶的纯度，并判断分子量。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴6) 重装:一般地说，一次装柱后，可反复使用，无特殊的“再生”处理，只须在每次层析后用3-4倍柱床体积的洗脱液过柱。由于使用过程中，颗粒可能逐步沉积压紧，流速逐渐会减低，使得一次分析用时过多，这时需要将凝胶倒出，重新填装；或用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行沉降。有时流速改变是由于凝胶顶部有杂质集聚，则需将混有脏物的凝胶取出，必要时可将上部凝胶搅松后补充部分新胶，经沉集、平衡后即可使用。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴4蛋白浓缩 (选作)蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴经纯化后收集的蛋白需经过蛋白浓缩以提高蛋白浓度。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴具体方法如下：蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1) 浓缩柱的清洗：用20%乙醇清洗，再用20ml双蒸水清洗。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2) 4000g离心30分钟，除去浓缩柱的双蒸水。弃去收集管中的废液。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴3) 取20ml收集的蛋白溶液于浓缩柱中。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴4) 4000g冷冻离心约30分钟。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴5) 取出残留在浓缩柱的蛋白溶液，保存在灭菌的1.5ml的离心管中。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴注意：离心时浓缩柱的滤膜要与离心机轴心垂直。浓缩终体积在200-500l之间时停止离心，取出浓缩后的蛋白时，移液枪要贴在浓缩柱的侧壁，以免枪头碰到滤膜使滤膜受到损害。蛋白浓度可提高40倍以上。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴重点内容：装柱，纯化及蛋白纯化图表制作！蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴五、思考题蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1. 选择大肠杆菌作为原核表达宿主菌的主要原因是什么？蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2. 那些因素影响外源基因在宿主中的高效表达？蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴3. 原核表达载体应包含哪些元件？蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴4. 如何避免表达蛋白的被选择性降解以及包含体的形成？蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴实验三、重组卤醇脱卤酶含量、纯度及活力检测蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴一、实验目的蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1掌握蛋白质分子量测定常用技术：Bradford蛋白浓度测定法；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法；蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴2掌握卤醇脱卤酶酶活力的测定方法及原理。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴二、实验原理蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴（一）Bradford蛋白浓度测定法原理蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488 nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595 nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01000 g/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和分子量测定。SDS-PAGE是在要进行电泳分析的样品中加入含阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）和-巯基乙醇的样品处理液，SDS可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二、三级结构；b-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，置沸水浴中煮沸35 min，使SDS与蛋白质充分结合，引起蛋白质变性、解聚、带上大量同种负电荷、形成棒状结构。制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，一般分离大分子量蛋白质需要使用较低浓度的分离胶；分离小分子量蛋白质需要使用较高浓度的分离胶。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl、甘氨酸阴离子以及蛋白质SDS复合物，在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl的电泳迁移率最大。在电场的作用下，Cl最初的迁移速度最快，这样在Cl后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质SDS复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可以被浓缩三百倍），所以在浓缩胶中Cl是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH值（通常pH = 8.8）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质SDS复合物，甘氨酸和Cl的界面很快超过蛋白质SDS复合物。这时蛋白质SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴（三）卤醇脱卤酶酶活测定原理蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴比色法：卤醇脱卤酶催化邻卤醇转化为相应的环氧化物时，会有卤离子的释放。卤离子，如氯离子或溴离子与Hg2+的相互作用使得Hg2+与SCN-分离，后者与Fe3+生成有色复合物，该物质在1小时内稳定，且可通过在460nm吸收值来确定。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴三、实验仪器和试剂蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴1电子分析天平（万分之一，千分之一），分光光度计，台式高速离心机，稳压稳流电泳仪，电泳槽，真空泵，微量注射器。蛋白质纯化实验指导书2电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术 电子科技大学教务处制表目 录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3附：大归难呼幕炬漂镑咎汁产滚领含恬活拱客截又法躯粮象唐筏奔咱部姐寒愤籽呐弦畦破正竞虏澳澜矢嚣虹浚罕激喻嘱颓巢焉萝谨红耶挑腕版沃担翟闷戴