诊断分子生物学基本技术

诊断分子生物学基本技术,诊断分子生物学基本技术,基础知识 实验基础 诊断技术 临床应用,ampr,半乳糖苷酶N端编码序列,变性与复性（denaturation and renaturation）,变性 在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即变性 增色效应 解链过程中，DNA的A260增加，并与解链温度有一定的关系，这重关系称为DNA的增色效应 复性 变性DNA在适当的条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象即复性 退火 热变性的DNA经缓慢冷却即可复性，这一过程称为退火,解链温度Tm(melting temperature),解链曲线 在连续加热DNA过程中，以温度对A260的关系作图，所得曲线称为解链曲线 解链温度 Tm 在解链曲线中，紫外线吸收值达到达50%时的温度为Tm。在Tm时，核酸分子内50%的双链结构被打开 Tm的影响因素 碱基组成 与G+C比例有关， G+C比例越高，Tm值越高 实验条件 例如三氯醋酸存在使Tm变小，氯化钠存在使Tm升高,基因载体（gene vector）,概念 把目的基因导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。 特点 自我复制 遗传标记 插入位点 种类 质粒 噬菌体 病毒,DNA连结酶（DNA ligase）,概念 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链的5-P末端，生成磷酸二酯键而形成完整的DNA链 种类 T4噬菌体DNA连结酶 T4噬菌体RNA连结酶 大肠E.coliDNA连结酶 作用 连接粘端 连接平端,目的基因（target gene）,概念 需要研究的基因叫目的基因。 来源 基因文库 存在于转化菌内、由克隆载体所带的所有基因组DNA的集合。 化学合成法 用DNA合成仪利用化学原理合成该核苷酸序列。 cDNA 以mRNA为模板， 利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA。 聚合酶链反应 在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA。,核酸的分离与纯化（the separation and purification of nucleic acid）,细胞的溶解 因标本而异 用SDS、Triton x-100 、 超声破碎等 核酸的分离 苯酚使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，将核酸分离 核酸的提取 冷乙醇或异丙醇沉淀核酸，离心回收核酸 去除杂质 70%的乙醇洗涤沉淀，除去处多余的盐类,核酸探针的标记（the labelling probe of nucleic acid）,概念 对已知碱基序列的单链核酸用示踪物进行标记得到核酸探针 示踪物分类 放射性核素类 优点 ： 灵敏度高、特异性高、不影响酶促反应。缺点：污染环境、损害人体。 非放射性核素类 抗原抗体免疫标记物地高辛、亲和配体标记物生物素、荧光标记物 FITC、电子密度标记物胶体金等。 标记方法 缺口平移法 随机引物法 末端标记法,缺口平移标记法（The label method of nick level moving）,概念 由Dnase 在DNA双链上切出随机切口，DNA聚合酶沿缺口水解5端核苷酸和3端修复加入被标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链，合成与模板互补的新链。 优点 快速、简便、成本相对低、比活性较高、标记均一，大分子标记效果好（1000bp）。 缺点 单链DNA、RNA、200bp不能用该法标记。,随机引物标记法(The label method of random primer),概念 采用6个核苷酸的随机引物 与模板DNA结合的原理将标记物掺入到新合成的DNA片段中去，完成探针标记反应。 随机引物 是指有各种可能排列组合顺序的混合物，能与任何核酸序列退火杂交，并为DNA聚合酶的反应起到引物作用。 方法 将双链DNA变性为单链，与随机引物退火杂交，在含有dNTP底物的示踪物的存在下，由Klenow片段催化下，从引物3末端开始按5-3方向合成新的互补DNA链，即标记的DNA探针。 优点 具有缺口平移标记法的优点，而且能标记任何长度的DNA及RNA。,末端标记法（The end- labelling method ）,概念 用核酸修饰酶对核酸片段的5或3末端进行部分标记，不对全长标记。 分类 Klenow片段末端标记法 在有标记的dNTP存在下， Klenow片段可以填充双链DNA凹陷的3末端，获得标记的DNA探针。 T4DNA聚合酶置换合成标记法 利用T4DNA聚合酶的3-5核酸外切酶和5-3核酸内切酶的作用，使3末端凹陷，加入有标记的dNTP，获得标记的DNA探针，用于末端为3突出粘端和平端的情况。 T4多聚核苷酸激酶标记法 T4多聚核苷酸激酶可将-32PATP的- 32P转移到DNA游离的5-OH上，还可催化- 32P与5末端的磷酸基团交换，因此无论是否5末端去磷酸均可用此法标记。,分子生物学实验诊断技术,核酸扩增技术 核酸杂交技术 多态性的分析 核酸序列分析 DNA重组技术,杂交核酸技术（The hybridization technique of nucleic acid）,核酸分子杂交 在DNA复性过程中，如果把不同的DNA单链分子或者把DNA与RNA放在一起，只要存在碱基配对关系，就可以在不同分子间形成杂化双链，这种分子现象为核酸分子杂交 核酸杂交技术 利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。 分类 斑点杂交 用于基因组 DNA或RNA的分析 Southern blot 用于基因组 DNA的分析 Northern blot 用于以知mRNA表达水平的分析 原位杂交 细胞内杂交，用于DNA或RNA的分析,Southern blot（1）,概念 用转膜法进行DNA杂交分析 步骤 提取消化 提取基因组DNA并将其经限制性内切酶消化成片段 电泳 将DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳变性使其成为单链 转膜 将硝酸纤维素（nitrocellulose,NC）膜放在胶上，上面放吸水纸，利用毛细作用使胶中DNA片段转移到NC膜上 杂交 此杂交膜在杂交 液中与探针杂交 显影 用放射自显影显示出杂交分子带,Southern blot （2）,Northern blot,概念 用转膜法进行RNA杂交分析 步骤 提取 总RNA的提取 电泳 将RNA片段在琼脂糖凝胶中电泳变性，防止发夹状结构形成 转膜 NC膜放在胶上，上面放吸水纸，利用毛细作用使胶中RNA片段转移到NC膜上 杂交 此杂交膜在杂交 液中与DNA探针杂交 显影 用放射自显影显示出杂交分子带 注意 所用试剂均用0.1% DEPC水配制 注意 所有器具均需高温处理,斑点杂交（dot hybridization technique ）,概念 核酸与探针直接在NC膜上杂交的方法 步骤 提取 提取DNA或RNA样品 点样 样品点在NC膜上， 烘烤使其固定在膜上 杂交 将膜、探针、杂交液封入杂交袋中，杂交 显影 用放射自显影显示出杂交分子点,原位杂交（in situ hybridization）,概念 保持细胞形态，在细胞内进行核酸杂交 步骤 固定标本 涂片或组织切片置微波炉中照射，固定标本 杂交 将探针（常用生物素标记法）复盖在标本上，加入杂交液，杂交 显色 载玻片放入缓冲液中，加入底物，显色。 摄影 显微镜下观察结果，摄影,核酸杂交技术与基因诊断（ The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis ）,限制性内切酶酶谱分析法 概念 利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因突变 原理 当待测DNA序列发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其片段的长度与数量在电泳迁移率上会随之改变。借此做出诊断 应用 检测基因突变的位点与数量,核酸杂交技术与基因诊断（ The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis ）,DNA限制性片段多态性分析（RELP） 概念 DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该片段会产生长度不同的片段，此片段为遗传标志，检测致病基因的带者 原理 在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对突变（称为中性突变），中性突变导致个体间的差异，叫DNA多态性。在某家族中，致病基因与特异多态性紧密连锁，此多态性为遗传标志 应用 遗传病的基因诊断,核酸杂交技术与基因诊断（ The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis ）,等位基因特异寡核苷酸探针杂交 概念 根据已知遗传病基因突变的核苷酸序列，人工合成寡核苷酸探针（突变与正常），分别与受检者杂交，判断其为突变的纯合子、杂合子、新的突变类型或正常 原理 若受检者只与突变探针杂交，则为突变纯合子；若与两种探针杂交，则为突变杂合子；若与正常探针杂交，则不存在该突变基因；若与两者均不杂交，提示新的突变。,聚合酶链反应PCR（polymerase chain reaction，PCR）,概念 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段 原理 以待扩增的DNA为模板，以一对与模板5和3末端互补的寡核苷酸片段为引屋，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制，合成新链，反复重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。 基本步骤 变性 95 使模板DNA完全变性为单链 应退火 较Tm低5，使引物与模板DNA退火结合 延伸 72 DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应,PCR与基因诊断（PCR and gene diagnosis）,目的基因的克隆（模板为cDNA或基因组） 利用特异性引物获得已知的目的基因 利用简并引物获得同源性的基因片段 利用随机引物随机克隆基因 基因的体外突变 可以随机设计引物在体外进行基因的嵌合、缺失、点突变等改造 DNA的微量分析 病原微生物的微量检测 突变基因的筛选 法医学的鉴定 DNA序列分析,PCR引物的设计（ The design of PCR primer）,长度 以扩增片段而定，一般1530个碱基，引物越长，特异性越强 碱基 GC含量以45%55%为佳，GC应随机分布 Tm值 Tm值应底于延长温度 引物内和引物间不宜形成二级结构 特异性 特异性强，不扩增目的基因以外的DNA,PCR扩增条件的设计（The design of PCR extension condition）,退火 一般Tm5，与目的基因长度有关，目的基因短，退火温度 可底，时间可短。退火温度 太高，有时会得不扩增产物，退火温度 太低，容易得不到产物 延伸 与目的基因长度有关，一般认为DNA聚合酶的聚合速度1000bp/min.时间太短，会得不到产物，时间太长，会出现Smear. 扩增次数 扩增次数太少，扩增量不足，扩增次数太多，提高灵敏度，易造成非特异性扩增，会出现Smear. 引物 引物过多，易出现双引物聚合，电泳出现小于100bp的带，引物过少，扩增量少。,PCR技术探讨（The investigation of PCR technique） Smear 现象,原因 酶量过多 变性时间过短 变性温度过低 dNTP量过少 延伸时间过长 循环次数过多 模板量过多,建议 0.5U递减 变性时间5秒递增 变性温度0.5递增 50um递增 10秒递减 2个循环递减 模板量20%递减,PCR技术探讨（The investigation of PCR technique 非特异性扩增,原因 引物浓度过高 引物设计不合理 酶量过多 循环次数过多 变性温度过低 延伸时间过短 模板量过多,建议 0.1um递减 改变引物位置与长度 0.5U递减 2个循环递减 2递增 10秒递增 酶量20%递减,单链构象多态分析技术（The analysis technique of single strand conformational polymorphism ）,概念 由DNA单链构象所决定迁移率的电泳技术 原理 在中性聚丙烯凝胶电泳时，DNA单链的迁移率除与长短有关，更取决于DNA自身折叠形成的由碱基顺序决定的构象，甚至单个碱基不同，迁移率就不同，因此检测出含有基因突变的DNA或RNA片段 特点 这项技术具有简便、快速、敏感、和经济等特点，适用于大样本基因变异的筛查,SSCP技术的应用（The application of SSCP technique）,适用于大样本基因变异的筛查 用于癌基因和抗癌基因突变的检测 DNA多态性分析 复等位基因的分析 遗传病的致病基因分析 基因制图,SSCP技术流程（The procedure of SSCP technique）,总RNA的提取 逆转录合成cDNA PCR特异扩增目的基因 目的基因变性 在中性聚丙烯凝胶电泳 凝胶的处理 同位素标记的样品放射自显影 银染法或溴化乙锭（EB）染色,参考条件（reference condition）,长度 目的基因小于400bp分离单链效果好，突变检出率高 温度 温度高，不利于分离突变DNA，最好采用恒温4或2026 交联度 低交联度、大孔径的聚丙烯酰胺凝胶有利于DNA互补链的分离，对DNA构型变化敏感，建议用12%C 甘油 是核酸的弱变性剂，能部分打开DNA单链的折叠结构，但浓度过大，降低迁移率，建议用510%的甘油 电压 影响分析结果，建议先用低电压，后加大电压的条件，分辨率高，电泳时间短,SSCP正常结果分析（The analysis of SSCP normal result）,位置 DNA单链在电泳中的位置无法预先确定，应设立未变性样品对照 条带数 由于单链构象的多样性，中间状态的存在，可以出现多条单链 突变条带 不一定在两条单链都表现出，有时可见于一条单链上 假阴性 用该法不能证明无突变发生，若无突变发生可以改变电泳条件 假阳性 筛选出泳动变位，不能完全排除假阳性,核酸序列分析(The sequence analysis of nucleic acid),DNA末断合成终止法 原理 在待测DNA的3末端人工合成引物，在DNA聚合酶的作用下，复制链延长，在ddNTP(2,3双脱氧核糖核苷三磷酸)存在下，复制延长随机受阻，形成分子量大小不等的片段。电泳分离，自显影，读分析碱基片段 步骤 标记 将单链模板DNA分成4份，每一管加入32PdATP、dNTP、引物和酶，每管还加入4种ddNTP中的一种，进行反应 电泳 聚丙烯酰胺凝胶高压（1600V）电泳，复制延长随机受阻，可形成一个核苷酸的差异的大小不等的片段 显影 电泳后干燥，对X光片进行放射自显影 图谱 自下往上读，得到5-3的碱基序列，其互补链是待测的DNA的3-5碱基序列,核酸序列分析(The sequence analysis of nucleic acid),复制模板 基因工程 M13是单链噬菌体，转染宿主菌复制为双链增殖，又以单链透出菌体。把待测DNA重组插入双链M13复制型DNA中，经培养扩增，可分离得到单链M13DNA，即复制模板 cDNA 提取样品总RNA，逆转录为DNA，特异扩增目的基因，纯化，即复制模板,基因工程（gene engineering）,概述 基因工程又称重组体DNA技术，是指在体外将不同来源的DNA分子进行重新组合，并使它们在适当的宿主细胞中实现增殖表达的遗传操作 主要步骤 目的基因的获取 载体的选择与构建 复制子的形成 转化 筛选复制子 表达外源基因,复制子（replicon）,概念 即重组DNA，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子 构建方式 粘性末端连接 平端连接 同聚物加尾连接,同聚物加尾连接（The ligation of adding- tail polymer）,概念 利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。 步骤 粘性末端 在末端转移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造粘性末端 连接 在连接酶作用下进行粘性末端连接,转化（transformation）,概念 把有复制能力，在细胞外无复制活性的复制子装入细胞，使其复制、扩增 步骤 感受态菌 增加细胞膜的通透性，便于复制子进入 转化 将感受态菌和复制子共同加热（42）、冰浴，使感受态菌热胀冷缩，把复制子导入菌体 转化菌培养 在培养基中扩大培养,筛选（screening）,概念 确定含有复制子的细菌的过程 方法 抗药性标志 含有抗药性标志的载体转化菌能在含该抗生素的培养板上生存，与非转化菌分开 标志补救 a互补又名蓝白筛选，根据B-半乳糖苷酶有a和B两个片段，只有宿主细胞和载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有B-半乳糖苷酶活性，使特异底物变为蓝色化合物 分子杂交 利用32P标记的探针与转移到硝酸纤维素膜上的转化子或目的基因的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因,目的基因的表达（The expression of target DNA）,原核表达体系 如E.coli 优点 简单、迅速、经济而又适合大规模生产工艺 缺点 缺乏转录后加工机制，不宜表达真核组DNA 缺乏适当的翻译后加工机制 表达的蛋白质常为不溶性的包涵体，使其有活性还需进行复杂的复性处理 很难在E.coli表达体系表达大量可溶性蛋制品,目的基因的表达（The expression of target DNA）,真核表达体系 优点 表达克隆的cDNA，也可表达真核基因组DNA 表达的蛋白质可被适当修饰 表达的蛋白质会恰当的分布在细胞内一定区域并积累 缺点 操作技术难、费时、不经济,基因工程与医学（gene engineering and medicine）,疾病基因的发现 发展生物制药 DNA诊断 基因治疗 遗传病的预防,