BaxBclXL在骨关节炎软骨及滑膜中表达的实验研究

Bax、Bcl-XL在骨关节炎软骨及滑膜中表达的实验研究 作者：欧阳侃 王大平 熊建义 刘黎军 刘建全【摘要】 目的 探讨 Bax、Bcl-XL 基因在骨关节炎软骨细胞及滑膜中的表达及意义。方法 成年新西兰大白兔 24 只，根据文献采用石膏固定方法制作骨关节炎动物模型，用免疫组化、原位末端标记技术（TUNEL）等方法检测 Bax、Bcl-XL 在兔膝关节软骨细胞及滑膜中的表达和软骨细胞凋亡情况。结果在滑膜细胞中 Bax、Bcl-XL 的表达实验组阳性率高于对照组（P < 0.01）；在软骨细胞中 Bax 的表达实验组阳性率高于对照 组（P < 0.01）；实验组软骨细胞凋亡程度与 Bcl-XL 的表达呈负相关（P < 0.05），与 Bax 的表达呈正相关（P < 0.01）。结论 Bax、Bcl-XL 基因与骨关节炎发生发展有密切关系。 【关键词】 骨关节炎；凋亡基因；软骨细胞；滑膜细胞 Abstract Objective To investigate the expression and significance of Bax、Bcl-XL in articular cartilage and synovium of osteoarthritic animal model. Methods The left knees of 24 rabbits were immobilized in full extension using plaster cast. Immunohistochemistry and TUNEL assay was used to detect the expression of Bax、Bcl-XL proteins in articular cartilage and synovium and the apoptosis of the articular chondrocytes and synovial cell of animal model. Results The positive expression rat of Bcl-XL protein in osteoarthritic synovium was higher than that in noral synovium (P < 0.01). The positive expression rat of Bax protein in osteoarthritic chondrocytes was higher than that in normal chondrocytes (P < 0.01). There was a positive correlation between degrees of the expression of Bax and chondrocytes apoptosis in osteoarthritic articular cartilage (P < 0.01), but a negative correlateion between degree of the expression of Bcl-XL and chondrocytes apoptosis in osteoarthritic articular cartilage (P < 0.05). Conclusion There was a consanguineous correlation between degrees of the expression of Bax Bcl-XL and chondrocytes apoptosis in osteoarthritic articular cartilage. It demonstrated that the abnormal expression of Bax, Bcl-XL closely related to the biological behaveior of OA such as occurrence, progress and so on. Key Words Osteoarthritis; Apoptosis control genes; Articular chondrocytes; Synovium cell 1 材料和方法 1.1 一般资料 成年新西兰大白兔 24 只，雌雄不限，年龄 68 个月，体重 2.03.1 kg，平均体重 2.5 kg。 1.2 模型制作及分组 根据文献1采用左后肢膝关节伸直位石膏管型固定方法制作骨关节炎（OA）模型，6 周后取左侧膝关节软骨及滑膜标本为实验组，对侧肢体膝关节软骨及滑膜标本为对照组。 1.3 标本处理及检测方法 新鲜标本以 10% 中性福尔马林液固定 48 h，关节软骨 10% EDTA 脱钙 67 周，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，厚 45 m。采用免疫组化 S-P 法检测 Bax、Bcl-XL 在兔膝关节软骨细胞及滑膜中的表达，TUNEL 法检测骨性关节炎软骨及滑膜细胞凋亡情况。 1.4 统计学分析 应用 SPSS 11.0 软件进行统计学分析，率的比较采用 检验和确切概率法，相关性检验采用斯皮尔曼（Spearman）等级相关检验，以 P < 0.05 为具有显著性差异。 2 结 果 2.1 Bcl-XL 蛋白的表达 Bcl-XL 蛋白免疫组化染色阳性物质定位于细胞质及细胞膜（图 1），在本实验中，实验组的软骨细胞、滑膜细胞及正常对照组的软骨细胞、滑膜细胞中均有阳性表达，阳性率分别为 20.83%、54.17% 及 33.33%、12.50%（表 1 ），在关节软骨细胞中的表达实验组阳性率低于对照组，但差异没有显著性（ =0.1179，P > 0.05）（表 2）；在滑膜细胞中的表达实验组阳性率高于对照组，差异具有显著性（ =9.375，P < 0.01）（表 3）。 2.2 Bax 蛋白的表达 Bax 蛋白免疫组化染色阳性物质定位于细胞质（图 2）。在本实验中，Bax 蛋白在实验组的软骨细胞、滑膜细胞及正常对照组的软骨细胞、滑膜细胞中均有阳性表达，阳性率分别为 75.00%、16.67% 及 29.17%、25.00%（表4），在关节软骨细胞中的表达实验组阳性率高于对照组，差异具有显著性（ =10.1，P < 0.01）（表 5）；在滑膜细胞中的表达实验组阳性率低于对照组，但差异没有显著性（ =0.5053，P > 0.05）（表 6）。 2.3 软骨细胞凋亡与 Bax 蛋白表达的关系 实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与 Bax 蛋白的表达呈正相关，Bax 蛋白表达阳性 18 例中，末端标记技术检测结果有 15 例为阳性，差异均具有显著性（rs=0.642，P < 0.01）（表 7），且连续切片观察发现，在 Bax 蛋白表达阳性的区域内常有 TUNEL 反应阳性分布；在滑膜中滑膜细胞凋亡程度与 Bax 蛋白的表达没有明显的相关性，Bax 蛋白表达阳性的 4 例中，末端标记技术检测结果有 3 例为阳性，但差异均不具有显著性（rs=-0.190，P > 0.05）（表 8）。 2.4 软骨细胞凋亡与 Bcl-XL 蛋白的表达的关系 实验组关节软骨细胞中，软骨细胞凋亡程度与Bcl-XL 蛋白的表达呈负相关，Bcl-XL 蛋白的表达阴性的 19 例中，末端标记技术检测结果有 15 例为阳性，差异具有显著性（rs=-0.488，P < 0.05）（表 7），在滑膜细胞中滑膜细胞凋亡程度与 Bcl-XL 蛋白的表达没有明显的相关性，Bcl-XL 蛋白的表达阴性的 11 例中，末端标记技术检测结果有 7 例为阳性，差异不具有显著性（rs=-0.200，P > 0.05）（表 8）。 3 讨 论 细胞的凋亡与细胞的增殖、生长、分化一样，是细胞生长发育的一种过程。有关细胞凋亡的发生机制非常复杂，可能是多基因参与调控，受多种促进因素和抑制因素共同作用的结果。目前已发现有二类细胞凋亡相关基因2，即促进细胞凋亡的基因和抑制细胞凋亡的基因。研究2 显示抑制细胞凋亡的基因主要是 Bcl-2 基因和 Bcl-2 相关基因（Bcl-XL，MCL-1），其编码的蛋白质能抑制细胞凋亡和延长细胞寿命，其抑细胞凋亡作用以 Bcl-2 最为重要。Bcl-2 家族成员促进或抑制凋亡的确切机制尚未确定。 Bax 基因是 Bcl 基因家族中的另一个凋亡促进基因。Bax 和 Bcl-2（B-cell lymphoma leukemia-2 gene，B 淋巴瘤白血病 2 基因）是一对正负调节基因，Bax 和 Bcl-2 蛋白都是均一二聚体，反应时需结合形成二聚体。Bax/Bcl-2 的比值对决定细胞接受刺激信号后存活与否有关，Bax/Bax 和 Bcl-2/Bcl-2 形成比率决定细胞是否进入凋亡通路：Bax/Bax 升高，细胞接受凋亡刺激信号后发生凋亡；Bcl-2/Bcl-2 增高细胞则不凋亡3，4。Bax/Bcl-2 在细胞内的表达比率是决定细胞在体内受到某种刺激后发生凋亡的一个重要因素5。许多研究已证实，在细胞凋亡异常的疾病中，有 Bax/Bcl-2 比率的异常即促凋亡基因 Bax 和凋亡抑制基因 Bcl-2 两者作用失调6，7。Bax 基因不但拮抗 Bcl-2 的凋亡抑制作用，而且有直接促进细胞凋亡的功能8。在本研究中，Bax 蛋白在关节软骨细胞中的表达实验组阳性率高于对照组，阳性率分别为 75.00% 及 29.17%，差异具有显著性（ =10.1，P < 0.01），且其阳性程度与软骨细胞凋亡程度呈正相关（rs=0.642，P < 0.01）。说明在骨关节中，软骨细胞的凋亡是增加的，其凋亡率的增加是与 Bax 基因的表达异常相关的，Bax 基因的高表达促进了软骨细胞的凋亡，可见 Bax 基因是促使关节软骨呈现关节炎的病理改变的重要因素之一。 Bcl-XL 也是 Bcl-2 基因家族中的一员，与 Bcl-2 氨基酸序列同源性达 43%，与其高度保守区的同源性达 73%，但二者的性能并不完全相同9，10。其抑制细胞凋亡的可能机制是11：抗氧化效应；阻止细胞内 Ca2+ 的内流；调节 k-ras/raf 介导的信号传递；阻止 p53 和 c-myc 在核内的定位，从而抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，减少该蛋白酶的底物多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶的降解。在哺乳动物中与 bax 结合，形成异源二聚体，而抑制细胞凋亡12，13。研究发现14，在细胞色素 C 凋亡诱导过程中，细胞色素 C 离开线粒体，与 Bcl-XL 结合后，阻止其在细胞质中堆积，从而抑制辐射诱导的细胞死亡。共转染实验发现15，Bcl-XL 能抑制 p53 介导的细胞凋亡。本实验中，Bcl-XL 在实验组的软骨细胞、滑膜细胞及正常对照组的软骨细胞、滑膜细胞中均有阳性表达，阳性率分别为 20.83%、54.17% 及 33.33%、12.50%，在关节软骨细胞中的表达实验组阳性率低于对照组，但差异没有显著性（ =0.118，P > 0.05）；在滑膜细胞中的表达实验组阳性率高于对照组，差异具有显著性（ =9.375，P < 0.01）。作者认为，Bcl-XL 在骨关节炎软骨及滑膜细胞中表达，可能是反应了机体对凋亡的一种调控，通过上调细胞凋亡抑制因子，保护软骨及滑膜细胞免遭凋亡16，至于其表达在软骨细胞中两组差异不具有显著性，可能是由于参与这种调控的凋亡抑制因子有多种，而 Bcl-XL 不是主要的调控因子9，10，16。【参考文献】 1 江捍平, 王大平. 骨关节炎动物模型J. 中国现代医学杂志, 2004, 14(6):153-1562 刘陶文. 凋亡调控基因 Bcl-2 家簇研究进展J. 生物化学与生物物理进展, 1999, 26(3):216-2183 Krasmeyer SJ, Shutter JR, Veis DJ, et al. 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