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第4章 菌种保藏的原理和方法,菌种保藏的重要意义在于如何保持优良菌种其优良性状的稳定，满足生产的实际需要。 菌种的保藏的基本原理都是根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使微生物处于代谢不活泼，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。 一般可以通过降低培养基营养成分、低温、干燥和缺氧等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。,斜面保藏法 45冰箱中保藏，保藏期36月 穿刺保藏法 45冰箱中保藏，保藏期612月 沙土管干燥保藏法 密封45冰箱中保藏，保藏期12年 真空冷冻干燥保藏法 安瓿管45冰箱中保藏，保藏期510年 液氮保藏法 安瓿管保藏在150或196的液氮中，保藏期23年 悬液保藏法 密封在10或室温（1820）保藏，保藏一年或更长 低温保藏法 密封20以下的低温中保藏，保藏期约在一年左右,保藏方法,第5章 微生物的代谢调节,在实际生产中，要达到超量积累产物，提高生产效率，必须打破微生物原有的代谢调控系统，在适当的条件下，让微生物建立新的代谢方式，高浓度地积累人们所期望的产物。 为达到这一目的，可以采用两种方式： 一种就是通过各种育种方法，选育基因突变株，从根本上改变微生物的代谢； 另一种是控制微生物的各种培养条件，影响其代谢过程。,5.1 微生物的代谢类型和自我调节,1. 代谢类型 微生物的生长繁殖主要是依赖于两种代谢途径，即分解代谢和合成代谢。 微生物的分解代谢和合成代谢是相互关联、相互制约的，成为其生命活动的基础。 1）微生物通过分解代谢将从环境中吸收的各种碳源、氮源等物质降解，为细胞的生命活动提供能源和小分子中间体。 2）微生物的合成代谢是利用分解代谢的能量和中间体合成氨基酸、核酸等单体物质，及蛋白质、核酸、多糖等多聚物。,2. 微生物自我调节的部位 许多化合物代谢的部位是受到控制的，有三种控制方式： 1）细胞膜对大多数亲水分子起一种屏障作用，但又存在着某些输送通道。 2）调节现有酶量和改变酶分子的活性。对酶量的调节可以通过增加或减少关键酶的合成或降解速率进行。 3）限制基质的有形接近。 微生物自我调节的三个部位实际上也就是三个类型，但都涉及到酶促反应调节。 酶促调节的方式包括酶活性调节和酶合成调节两大类。从调节作用的特点上看，酶活性调节的效果是即时而又迅速的；而酶量调节涉及到酶蛋白合成，所以调节的效果较慢。这两种调节方式往往同时存在于同一个代谢途径中，而使有机体能够迅速、准确和有效地控制代谢过程。,5.2 酶活性调节,1. 酶的激活作用和酶的抑制作用 酶活性调节包括两个方面，即酶的激活作用和酶的抑制作用。 酶的激活作用是指在某个酶促反应系统中，某种低分子质量的物质加入后，导致原来无活性或活性很低的酶转变为有活性或活性提高，使酶促反应速率提高的过程。能引起酶的活力提高（或获得）的物质称为酶的激活剂。 酶的抑制作用是指在某个酶促反应系统中，某种低分子质量的物质加入后，导致酶活力降低的过程。能引起酶的活力降低（或丧失）的物质称为酶的抑制剂。 激活剂和抑制剂可以是外源物质，也可以是机体自身代谢过程中产生与积累的代谢产物。,2. 酶活性调节的机制 酶活性调节的机制包括酶的变构理论和酶分子的化学修饰调节理论。 1 ）变构调节理论 变构调节是通过条件的变化，使酶分子空间构型上的变化来引起酶活性的改变。变构酶一般具有相当高的分子质量，并由多个亚基组成，这些亚基多是相同的。每个亚基都具有催化和变构调节的位点。 2）变构分子内部的化学修饰作用 有的变构酶可以通过修饰酶作用与某种物质以共价键结合，导致酶的化学组成发生变化，从而提高或降低酶的活性。当酶不与这种特定的物质结合时，该酶的活性就丧失（或降低），或者获得活性（或提高活性）。,5.3 酶合成的调节,酶量调节的方式包括诱导和阻遏两种类型。 1)诱导作用指在某种化合物（包括外加的和内源性的积累）作用下，导致某种酶合成或合成速率提高的现象。 诱导酶又称为适应性酶，是依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶。能够诱导某种酶合成的化合物称为该酶的诱导剂。 诱导剂可以是诱导酶的底物，也可以是底物的结构类似物。 一种诱导酶的合成可以有一种以上的诱导剂，但不同的诱导剂的诱导能力不同。并且诱导能力还与诱导剂的浓度有关。 当某种物质加入后，引起细胞代谢速率提高可以是激活，亦可以是诱导，这可用酶的定量分析方法来确定。,5.3 酶合成的调节,2)阻遏作用是指在某种化合物作用下，导致某种酶合成停止或合成速率降低的现象。 如果代谢产物是某种合成途径的终产物，这种阻遏称为末端产物阻遏；如果代谢产物是某种化合物分解的中间产物，这种阻遏称为分解代谢产物阻遏。,5.4 分支生物合成途径的调节,许多生物合成途径具有两个以上的末端产物，这种分支合成途径的调节方式比直链式代谢途径要复杂得多。调节机理包括： 同工酶调节 协同反馈调节 累加反馈调节 增效反馈调节 顺序反馈调节 激活和抑制联合调节 酶的共价修饰等方式,5.5 能荷调节,能荷是指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度。细胞的能荷可由下式计算： 当细胞中全部是ATP时，能荷最大，为100；若全部是AMP时，能荷最小，为 0；而当全部为 ADP时，能荷为 50。 能荷调节也称腺苷酸调节，指细胞通过改变 ATP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动。它们所含能荷依次递减。上述三者在细胞中的含量不同，表明细胞的能量状态不同。 能荷不仅调节形成ATP的分解代谢酶类的活性，也调节利用ATP的生物合成酶类的活性。,5.6 代谢调控,在人为控制的条件下，可以使微生物过量产生各种初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。 1. 发酵条件的控制 1）改变各种发酵条件 2）使用诱导物 3）添加生物合成的前体 4）培养基成分和浓度的控制 2. 改变细胞透性 加入某种物质改变细胞的通透性。 3. 菌种遗传特性的改变 改变微生物的遗传特性，即改变酶的活性或酶的合成系统，使之对反馈调节不敏感，也能够达到过量生产代谢产物的目的。如利用各种突变株。,5.7 初级代谢和次级代谢,5.7.1初级代谢和次级代谢 初级代谢是一类普遍存在于生物中的代谢类型，是与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。初级代谢过程自始至终都存在于一切生活细胞之中，并与机体的生长过程呈平行关系。初级代谢产物，都是有机体生存必不可少的物质，这些物质的合成中的任何环节发生障碍，有可能引起生长停止，甚至导致机体发生突变或死亡。 次级代谢是某些微生物为了避免代谢过程中，某种代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型，通常是在生长后期合成。通过次级代谢合成的产物称为次级代谢产物，这些代谢产物并不是微生物生长所必需的，即使在这些代谢的某个环节上发生障碍，也不会导致机体生长停止或死亡，仅仅是影响了机体合成次级代谢产物的能力。次级代谢则仅在机体生长的某一个时期产生，或在微生物的对数生长期后期或在稳定期，与微生物的生长不呈平行关系。,5.7 初级代谢和次级代谢,在不同的微生物中，初级代谢产物基本相同，而次级代谢产物是非常不同的。 初级代谢对环境变化的敏感性比较小，即遗传稳定性强，而次级代谢对环境条件的变化很敏感，其产物的合成往往会因环境条件的变化而停止。 催化初级代谢产物合成的酶专一性强，而催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强。,5.7.2 次级代谢的调节类型,次级代谢产物的种类在不同的微生物中非常不同，所以次级代谢途径远比初级代谢复杂。已知抗生素等次级代谢产物生物合成的调控类型包括诱导调节、碳分解产物调节、氮分解产物调节、磷酸盐调节、反馈调节、生长速度调节等。,5.8 代谢工程,代谢工程是指利用基因工程技术，定向地对细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微生物的代谢特性，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的代谢途径，生产新的代谢产物的工程技术领域。 1.改变代谢途径 改变代谢途径是指改变分支代谢途径的流向，阻断其它代谢产物的合成，以达到提高目标产物的目的。改变代谢途径有各种方法，如加速限速反应、改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢途径等不同方法。,5.8 代谢工程,2.扩展代谢途径 扩展代谢途径是指在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物。或使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料合成代谢产物。 3.转移或构建新的代谢途径 转移或构建新的代谢途径系指将催化一系列生物反应的多个酶基因，克隆到不能产生某种新的化学结构的代谢产物的微生物中，使之获得产生新的化合物的能力；或利用基因工程手段，克隆少数基因，使细胞中原来无关的两条代谢途径联结起来，形成新的代谢途径，产生新的代谢产物；或将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一微生物中，使之发生代谢转移，产生目的产物。,
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