植酸酶工业化发酵生产技术研究课件

LOGO植酸酶发酵生产技术研究植酸酶发酵生产技术研究 温州大学温州大学 杨海龙杨海龙LOGOPage 2一、酶制剂在饲料中的应用n 饲料中添加酶制剂的研究最早始于上世纪中叶，饲料中添加酶制剂的研究最早始于上世纪中叶，7070年代，美国把微生年代，美国把微生物酶制剂添加到大麦饲料中，取得了显著效果，并引起了普遍重视。物酶制剂添加到大麦饲料中，取得了显著效果，并引起了普遍重视。n 饲料用酶目前已成为世界工业酶产业中增长速度最快、势头最强劲的饲料用酶目前已成为世界工业酶产业中增长速度最快、势头最强劲的一部分。一部分。n 饲料用酶制剂的作用：可缓解饲料资源短缺、人畜争粮的局面；促进饲料用酶制剂的作用：可缓解饲料资源短缺、人畜争粮的局面；促进动物的生长；提高饲料利用率，减轻环境污染，保障养殖业的可持续动物的生长；提高饲料利用率，减轻环境污染，保障养殖业的可持续发展。发展。LOGOPage 3n 目前世界上生产用酶多达目前世界上生产用酶多达300300多种，饲料用酶近多种，饲料用酶近2020种，主要有：种，主要有：n-淀粉酶淀粉酶n 糖化酶糖化酶n 蛋白酶蛋白酶n 纤维素酶纤维素酶n 木聚糖酶木聚糖酶n-葡聚糖酶葡聚糖酶n-半乳糖苷酶半乳糖苷酶n-甘露聚糖酶甘露聚糖酶n 果胶酶果胶酶n 植酸酶植酸酶n 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶n 黄曲霉毒素分解毒黄曲霉毒素分解毒LOGOPage 4 植酸酶植酸酶(EC 3.1.3.8(EC 3.1.3.8或者或者EC3.1.3.26EC3.1.3.26，肌醇六磷酸盐磷酸水解酶，肌醇六磷酸盐磷酸水解酶)是是催化植酸及植酸盐水解为肌醇和磷酸（或磷酸盐）的一类水解酶的统称。催化植酸及植酸盐水解为肌醇和磷酸（或磷酸盐）的一类水解酶的统称。目前已知的植酸酶包括肌醇六磷酸目前已知的植酸酶包括肌醇六磷酸3-3-磷酸水解酶、肌醇六磷酸磷酸水解酶、肌醇六磷酸6-6-磷酸水磷酸水解酶。解酶。植酸酶是一种环保型饲料添加剂，能使饲料中植物有机磷得到有效植酸酶是一种环保型饲料添加剂，能使饲料中植物有机磷得到有效的利用，从而减少畜禽养殖业对环境中的磷污染；并可解除植酸的抗营的利用，从而减少畜禽养殖业对环境中的磷污染；并可解除植酸的抗营养作用，改善畜禽生长性能，提高饲料的利用率，并促进动物对蛋白质、养作用，改善畜禽生长性能，提高饲料的利用率，并促进动物对蛋白质、氨基酸和碳水化合物的消化吸收。氨基酸和碳水化合物的消化吸收。二、植酸酶及其应用LOGOPage 5 植酸酶是一种新型的食品添加剂，能够降低食物中的植酸而改善人体植酸酶是一种新型的食品添加剂，能够降低食物中的植酸而改善人体对磷、锌、钙、铁等矿物质的吸收；或作为食品加工助剂，在加工时减少对磷、锌、钙、铁等矿物质的吸收；或作为食品加工助剂，在加工时减少食品中植酸的含量，改善食品性能，提高营养价值。在医药工业中，植酸食品中植酸的含量，改善食品性能，提高营养价值。在医药工业中，植酸酶用于生产低磷酸肌醇或肌醇。酶用于生产低磷酸肌醇或肌醇。另外，在酒精工业，植酸酶可促进发酵、提高酒精产量、减少杂质生另外，在酒精工业，植酸酶可促进发酵、提高酒精产量、减少杂质生成，并能显著降低蒸馏清液和酒糟中的植酸含量；植酸酶还可作为肥料添成，并能显著降低蒸馏清液和酒糟中的植酸含量；植酸酶还可作为肥料添加剂，分解转化土壤中的植酸，以释放出无机磷，进而提高土壤中磷的利加剂，分解转化土壤中的植酸，以释放出无机磷，进而提高土壤中磷的利用率和土壤磷素的含量。用率和土壤磷素的含量。LOGOPage 6三、植酸酶发酵生产1 1、菌种、菌种n 自然界中产植酸酶的微生物种类繁多，细菌、酵母、霉菌都分泌一定自然界中产植酸酶的微生物种类繁多，细菌、酵母、霉菌都分泌一定量的植酸酶。如量的植酸酶。如Aspergullus nigerAspergullus niger、Escherichia coliEscherichia coli，Klebsiella sp.Klebsiella sp.，Schwanniomyces castelliiSchwanniomyces castellii，Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae，Arxula adeninivoransArxula adeninivorans，Cladosporium spCladosporium sp，Aspergillus ficuumAspergillus ficuum，A.terreusA.terreus，Penicillium simplicissimumPenicillium simplicissimum等。等。n 植酸酶在天然材料中含量较低，生产成本高。基因工程技术的发展，植酸酶在天然材料中含量较低，生产成本高。基因工程技术的发展，为解决这一问题提供了有效途径。为解决这一问题提供了有效途径。LOGOPage 72、植酸酶的固态发酵生产植酸酶的固态发酵生产n 固体发酵法是以麸皮、玉米淀粉、黄豆饼粉等农副产品或加工废弃物，固体发酵法是以麸皮、玉米淀粉、黄豆饼粉等农副产品或加工废弃物，如稻草、米糠、榨油后的油饼（如椰子油饼、芝麻油饼、棕榈油饼、如稻草、米糠、榨油后的油饼（如椰子油饼、芝麻油饼、棕榈油饼、花生油饼）等为主要原料，微生物是在有足够湿度的固态底物上进行花生油饼）等为主要原料，微生物是在有足够湿度的固态底物上进行反应，发酵环境接近于自然状态下的微生物生长习性，产生的酶系更反应，发酵环境接近于自然状态下的微生物生长习性，产生的酶系更全，可直接加工成饲料用酶。全，可直接加工成饲料用酶。n 固体培养设备比较简单、成本低、产生的废弃物少、易于推广，但放固体培养设备比较简单、成本低、产生的废弃物少、易于推广，但放大比较困难、培养参数控制较复杂、容易污染杂菌，而且生产的植酸大比较困难、培养参数控制较复杂、容易污染杂菌，而且生产的植酸酶分离纯化较复杂。酶分离纯化较复杂。LOGOPage 83 3、植酸酶的液态发酵生产、植酸酶的液态发酵生产n 液态发酵的培养条件容易控制，不易污染杂菌，生产效率高。目前植液态发酵的培养条件容易控制，不易污染杂菌，生产效率高。目前植酸酶的工业化生产主要采用液态发酵工艺。酸酶的工业化生产主要采用液态发酵工艺。LOGOPage 9n 目前主要是以基因工程手段得到植酸酶的高产菌，并与高密度发目前主要是以基因工程手段得到植酸酶的高产菌，并与高密度发酵工艺相结合，实现植酸酶的高效生产。酵工艺相结合，实现植酸酶的高效生产。n 国内外用于表达植酸酶基因的宿主细胞主要是毕赤酵母（国内外用于表达植酸酶基因的宿主细胞主要是毕赤酵母（Pichia Pichia pastorispastoris）。）。发酵工艺包括：种子培养发酵工艺包括：种子培养接入发酵罐细胞培养接入发酵罐细胞培养流加碳源实现细胞的高密度培养流加碳源实现细胞的高密度培养外源植酸酶基因的诱导表达等外源植酸酶基因的诱导表达等阶段。阶段。LOGOPage 10n 研究的工艺参数：研究的工艺参数：n 培养基培养基n 培养条件培养条件n 高密度发酵工艺（补料工艺、诱导工艺等）高密度发酵工艺（补料工艺、诱导工艺等）n 制剂技术制剂技术n 液态酶的稳定条件液态酶的稳定条件LOGOPage 11n 目前植酸酶主要用于饲料行业，发酵后的酶液经菌体去除、浓缩（生目前植酸酶主要用于饲料行业，发酵后的酶液经菌体去除、浓缩（生产低酶活产品不需浓缩）、与载体混合、干燥等工序得到成品，产品产低酶活产品不需浓缩）、与载体混合、干燥等工序得到成品，产品中含有部分菌体、发酵培养基及其它杂质，应用分离技术生产理化、中含有部分菌体、发酵培养基及其它杂质，应用分离技术生产理化、微生物指标要求更高的植酸酶产品，使之在食品与医药工业得到应用。微生物指标要求更高的植酸酶产品，使之在食品与医药工业得到应用。n 通过高效基因工程菌构建、发酵工艺优化等技术手段，降低植酸酶的通过高效基因工程菌构建、发酵工艺优化等技术手段，降低植酸酶的生产成本、提高植酸酶的生产效率，并生产不同条件下作用的植酸酶生产成本、提高植酸酶的生产效率，并生产不同条件下作用的植酸酶品种，应用于生物肥料等新领域。品种，应用于生物肥料等新领域。n 探索耐热植酸酶基因工程菌构建，或通过制剂技术提高植酸酶的耐热探索耐热植酸酶基因工程菌构建，或通过制剂技术提高植酸酶的耐热性以提高其使用效率与范围。性以提高其使用效率与范围。n 工程菌的安全性评估。工程菌的安全性评估。四、植酸酶研究展望LOGOPage 12n 经160h发酵（30-90h混合诱导，90-160甲醇诱导）酶活平均为28537U/mL。进口甲醇补料实验进口甲醇补料实验0500010000150002000025000300003500040000024487296120144发酵时间（发酵时间（hr）酶活（酶活（u/ml）050100150200250300350400湿重（湿重（g/l）酶活（u/ml）湿重（g/L）LOGOPage 13n 经160h发酵（30-90h混合诱导，90-160甲醇诱导）酶活平均为28214U/mL。与进口甲醇相比差别1%。国产甲醇补料实验国产甲醇补料实验0500010000150002000025000300003500040000024487296120144发酵时间（发酵时间（hr）酶活（酶活（u/ml）050100150200250300350400450湿重（湿重（g/l）酶活（u/ml）湿重（g/L）LOGOPage 14四、不同甲醇补料速度试验n 与恒速流加相比，逐渐增加诱导表达阶段甲醇的补加速度，可适当减少菌体的生产量，有利于后期的搅拌与通气。不同甲醇补料速度比较不同甲醇补料速度比较050001000015000200002500030000350004000045000024487296120144168发酵时间发酵时间hr酶活（酶活（u/ml）050100150200250300350400450500湿重（湿重（g/L）恒速酶活（u/ml）递增酶活（u/ml）恒速湿重（g/L）递增湿重（g/L）LOGOPage 15五、植酸酶的低盐发酵试验n 原原发酵培养基中的发酵培养基中的KH2PO4 从从0.5%减至减至0.4%（图（图A）、）、K2SO4 从从1%减至减至0.8%（图（图B），结果表明酶活无显著差异。），结果表明酶活无显著差异。LOGOPage 16n 原原发酵培养基中的发酵培养基中的MgSO4从从1.5%减至减至1.2%（图（图C）、）、NH4H2PO4 从从4%减减至至3%（图（图D），结果表明酶活无显著差异。），结果表明酶活无显著差异。LOGOPage 17n 原原发酵培养基中的主要盐类全部减少发酵培养基中的主要盐类全部减少15%（低盐（低盐1）和）和30%（低盐（低盐2），），结果表明减少结果表明减少30%对菌体生物量和酶活都有显著的影响。生产中可对对菌体生物量和酶活都有显著的影响。生产中可对原原发酵培养基中的主要盐类减少发酵培养基中的主要盐类减少15%。Page 18谢谢！谢谢！欢迎光临温州大学指导！