蛋白质的分离纯化.ppt

1,基因工程下游技术简介,2,下游工艺的大体步骤 细胞扩增 细胞破碎 离心分离 （溶解包涵体） 层析分离 （离子交换层析 反相层析 疏水层析 凝胶层析 亲和层析等）,3,发酵工程主要指利用微生物、包括利用基因工程改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中大量扩增的技术。 现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用的结果。,发酵工程（细胞扩增）,4,5,动物细胞培养,细胞工程,6,7,单细胞藻类培养,细胞工程,一些单细胞低等植物如单细胞藻类的大规模培养成为细胞工程的重要组成部分 获得蛋白质资源、营养食品、精细化工产品等等,8,分离纯化的要求,1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白质的一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2、活性：要求保持天然构象状态，有高度的生物活 性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。,9,细胞破碎方法,1. 机械法： 1) 研磨：将样品置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常用10000r/min20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将细胞打碎。,10,2.物理法： 1) 反复冻融法：将细胞冷至15到20，然后放于室温(或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。,11,3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000105Pa2000105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。,12,细胞器的分离,细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网等，植物细胞还有叶绿体。 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。,13,细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。,14,粗分级分离,主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开。 优点：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质。 缺点：分辨率低，产品杂质多,15,1. 盐析（中性盐沉淀）,在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。 盐析法多用于蛋白质分离， 已有八十多年的历史，其突出的优点是： 成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。,16, 盐析的基本原理,蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素为：水化膜和电荷。 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水溶胶，蛋白质分子聚集形成沉淀。,17,溶解度,盐浓度,Salting-out,Salting-in,18,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,等点电时的蛋白质（亲水胶体）,带负电荷蛋白质（亲水胶体）,脱水,脱水,脱水,带负电荷蛋白质（疏水胶体）,不稳定蛋白颗粒,阴离子,阳离子,碱,酸,酸,蛋白质聚集沉淀,带正电荷蛋白质（亲水胶体）,碱,+,+,水化膜,带正电荷蛋白质（疏水胶体）,19, 中性盐的选择,常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（04）进行。由下表可以看到， 硫酸铵在0时的溶解度，远远高于其它盐类：,20,几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）,0 20 80 100 （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 硫酸铵在0时的溶解度，远远高于其它盐类：,21,2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75的杂蛋白，纯度提高了四倍。 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用23mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。 4) 价格便宜，废液不污染环境。,22,（3）分段盐析,不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。,血清,球蛋白,清蛋白,(NH4)2SO4,50%饱和度,饱和,析出,析出,23,（4）盐析的影响因素,1) 蛋白质的浓度：若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.53.0，相当于25 mg/mL30mg/mL。 2) pH值：在等电点处溶解度小，因此溶液的pH值常选在该蛋白质的等电点附近。 3) 温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的蛋白质，要求在04下操作，以避免活力丧失。,24,2.有机溶剂沉淀法,基本原理 降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。,25,（2）有机溶剂沉淀法的优点,分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋除去有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。 其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。,26,3.等电点沉淀法,具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离。蛋白质是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。 由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。,27,5. 有机聚合物沉淀法,有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。 其中应用最多的是“聚乙二醇” ( Polyethylene Glycol 简写为 PEG )，它的亲水性强，对热稳定，有广泛的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为600020000的 PEG。,28,本方法的优点是： 操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。 沉淀后有机聚合物容易去除。,29,6. 透析,自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都可使用透析技术。 透析只需要使用专用的半透膜即可。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。,30,7. 超滤,超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业操作技术。 超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。 超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。,31,加压的蛋白质溶液,浓缩的蛋白质溶液,含小分子的溶液,32,超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。 微孔过滤所用的操作压通常小于4104Pa，膜的平均孔径为500埃14微米（1微米104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。 超滤所用操作压为4104Pa7105Pa，膜的平均孔径为10100埃，用于分离大分子溶质。 反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35105Pa140105Pa，膜的平均孔径最小，一般为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。,33,（二）精分级分离,一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯通常使用高分辨率的柱层析方法。 常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析和金属螯合层析等。 另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。,34,常用的层析方法 凝胶过滤 离子交换层析 疏水层析 反相层析 亲和层析,35,层析技术原理,层析技术是一种物理的分离方法。其系统通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。,36,各类层析的原理和载体,类别 分离原理 基质或载体 吸附层析 化学、物理吸附 硅胶、氧化铝 、羟基磷酸 分配层析 两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土 、硅胶 凝胶层析 分子筛效应的排阻效应 sepharose 、sephadex 离子交换层析 离子基团的交换反应 离子交换树脂 、纤维素、 葡聚糖 亲和层析 分离物与配体之间有 带配基的sepharose 特殊亲和力 或sephadex 聚焦层析 等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团的配体相偶联的 sepharose 6B）,37,吸附层析（absorption chromatography）,原理：以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被解吸，然后又再被吸附、再解吸再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。,载体 ： 硅胶 氧化铝 羟基磷灰石,38,分子筛（凝胶）层析（gel-filtration chromatography）,原理 （见后）,基质 葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（sepharose）,应用 测定分子量 脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子 除去热原物质,39,40,凝胶过滤（分子筛） 根据不同分子量选择不同凝胶 Sephadex: 交联葡聚糖 G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值 X 10 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶,41,用于凝胶过滤的凝胶有多种，基本结构为内部带有孔洞的球状颗粒。装入玻璃管或不锈钢管内，叫做凝胶层析柱。待分离的混合物加在层析柱的上端，当混合物向下移动时，大分子不进入凝胶的内部孔洞，从凝胶颗粒之间移动；而小分子不但在凝胶颗粒之间移动，还会进入凝胶颗粒的内部孔洞，这样，大分子先从层析柱底端流出，小分子晚流出。达到分离的目的。,42,a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定,应用,43,44,离子交换层析 离子交换介质是一些表面带有电荷的颗粒，可以结合带有异性电荷的离子。蛋白质或核酸的分子，一般都带有电荷，不同的蛋白质或核酸，携带的电荷可能有差异，根据这些差异，进行蛋白质或核酸的分离。,45,1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合,2.吸附阶段：样品与反离子进行交换,3、4. 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质,5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤， 即可重复使用。,46,原始缓冲溶液的反离子,47,疏水层析 疏水层析的介质表面有疏水基团，可与蛋白质分子的疏水基团结合，不同的蛋白质分子结合的力量不同，也可实现混合物分离的目的。,