成栋学院实验指导

实验一 细胞膜的渗透反应一、实验目的。了解细胞膜对物质通透性的一般规律： 细胞膜的渗透性及各类物质进入红细胞的速度。2.了解溶血现象及其发生机制。二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的,水是生物界最普遍的溶剂,水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内,可使细胞胀破,血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液,这种现象称为溶血.将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对某些溶质具有通透性，溶质可进入细胞内,导致膜内渗透压升高,胞外的水随之进入细胞内，发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞进度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料,将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化，判定红细胞对不同物质的通透性如何.三、实验材料 鸡血四、实验器材50l小烧杯、0m移液管、试管（ml）、试管架.五、实验试剂抗凝剂：肝素（5 g/ml）0.17氯化钠0.M氯化铵0。1醋酸铵07M硝酸钠0。12M草酸铵0。12硫酸钠032M葡萄糖0.2M甘油032乙醇032M丙酮六、实验方法（一）鸡红细胞悬液以肝素液湿润5ml注射器内壁，推出多余的肝素液（针头内必须留下肝素液,不要进空气），取鸡的静脉血2m左右。取50小烧杯一只，加一份鸡血和十份0。17氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液体,此即稀释的鸡血.（二）低渗溶液取试管一只加入10l 蒸馏水,然后再加入1ml 稀释的鸡血，混匀，注意观察溶液的颜色变化，由不透明的红色逐渐澄清，红细胞发生破裂，造成00红细胞溶血,使光线比较容易透过溶液.（三)鸡红细胞的渗透性1、取试管一只，加入。17M氯化钠溶液10ml,再加入1ml 稀释的鸡血,轻轻摇动，注意是否有颜色变化？是否有溶血现象?为什么？2、取试管一只,加入0.17氯化铵溶液10m ,再加入1l 稀释的鸡血，轻轻摇动，注意是否有颜色变化？是否有溶血现象?若发生溶血，记下时间（自加入1m稀释鸡血到溶液变成红色透明澄清所需时间).3、分别在下列八种等渗溶液中进行实验,步骤同2。（1)0。1M醋酸铵(2）0.7M硝酸钠()。12M草酸铵(4)0。12硫酸钠(5）02M葡萄糖（6)0.32M甘油（7)0。32M乙醇(8)32丙酮七、注意事项.肝素用量要适宜，过少无抗凝作用,过多易导致溶血.2为了保证实验结果的精确性,应准确计时，并确定开始计时的标准和完全溶血的标准。3有的溶液不发生溶血,有的发生溶血时间比较长，可以将他们与对照组(氯化钠组）一起对比,如果发现有溶血现象但尚未完全溶血的说明该溶液可使血细胞发生溶血，只是时间未到，但是如果与对照无差别，说明它不会使血细胞溶血.八、实验报告将观察到的现象记录，并进行分析比较和讨论（填写表格)。管号处理是否溶血时间（单位)结果分析110m氯化钠+1l稀释鸡血210ml氯化铵1m稀释鸡血30m醋酸铵1l稀释鸡血0ml硝酸钠1ml稀释鸡血50l草酸铵+ml稀释鸡血60ml硫酸钠1ml稀释鸡血7ml葡萄糖+1稀释鸡血810ml甘油稀释鸡血910m乙醇+m稀释鸡血1010ml丙酮ml稀释鸡血九、思考1.红细胞在不同溶液中溶血时间为什么不同？试述细胞膜有哪些种跨膜运输的机制？ 实验二 红细胞的计数一、实验目的掌握动物细胞计数的方法。二、实验原理细胞计数板是由特殊硬质玻璃载物片构成。计数板的中央部分有四条沟,形成三条隆起,两边较窄的隆起，是放置盖玻片用.中央较宽隆起部分,可有一个或两个计数室用来计数白细胞和红细胞。中央的隆起比两边的隆起低01毫米,因此盖上盖玻片，在这一间隙中充满红细胞稀释液时，其深度恰好为0。1毫米.其计数部分是由一个长mm宽深0。m的小室，其上被等分为9个大方格(其边长为1mm），中间的大方格又用双线等分为25个中方格(其边长为1m/0.2m），每个中方格又被单线等分为个16小方格(小方格的边长为02m/4=。0mm）.计数时，通常选择计数室中央大方格四角和中央的五个中方格（每个中方格包含16个小格）来计数。三、实验材料 鸡血。四、实验器材 剪刀 玻璃毛细管 载玻片细胞计数器 细胞计数板和相应的盖玻片 复式显微镜五、实验试剂抗凝剂：肝素(5mml）。 血细胞稀释液：aCl 。9g，加蒸馏水至100ml.六、实验方法、杀鸡取血，加入适量抗凝剂（取03l/肝素于试管内,可抗凝13ml血液）;计数前将鸡血适当稀释（稀释2倍）.2、在细胞计数板（见图)的两条窄的隆起上涂一些液体，按住盖玻片从下方推上.图1细胞计数板的外观3、用玻璃毛细管吸取鸡血稀释液于放有盖片的细胞计数板的边缘，液体自然流入盖玻片下的空隙,均匀地充满计数板小室即可.注意：向细胞计数板加鸡血稀释液时加量要适当,过多使盖玻片漂移,过少使计数板的小室内有气泡产生,不理想时要重新滴加，否则会影响细胞计数的效果。、静置2mi,待细胞稍沉降,先在低倍镜下观察红细胞是否分布均匀(见图2），如分布不均匀，就应洗后重做。若分布均匀,则在普通光学显微镜的“10”物镜下进行细胞计数.先调焦，看清计数板上的格线,然后将五个红细胞计数的中方格逐个移入视野中心，逐一计数（每一中格内含有16个小格）。对于细胞压线者，则遵循数上不数下、数左不数右的原则。计数后按下式计算：鸡血红细胞数ml血液=（5个中方格的鸡血红细胞总数/5）2。5l稀释倍数注:每个中方格的体积是（。mm)20.1m=103m=m,因此：每毫升细胞数稀释倍数每个中方格细胞数/（410）= 每个中方格细胞数2105稀释倍数图2 细胞计数室示意图七、注意事项、肝素用量要适宜,过少无抗凝作用，过多易导致溶血.2、在观察时应将显微镜的光调弱，这样有利于更加清晰的观察到计数板横竖格线.八、实验报告1、鸡血红细胞计数12345平均每个中方格血细胞数2、血细胞数 ml血液=九、思考题1、为什么向计数板上加血液样品要事先稀释100200倍？2、细胞计数板计数的原理是什么？3、为什么要对个中方格的红细胞计数后取平均值来计算每毫升血液中所含细胞数？实验三 红细胞的显微测量一、实验目的掌握动物细胞显微测量的基本原理和使用方法二、实验原理细胞的大小，一般可用显微测微尺来测量。显微测微尺是由目镜测微尺和镜台测微尺组成的,两尺必须配合使用。目镜测微尺是放入目镜内的一种标尺,是一特制的圆形小玻片，其上刻有0或00等分的刻度，每一刻度所代表的长度随放大倍数而改变。因此,使用前必须测定。镜台测微尺是在一块载玻片中央由圆形盖玻片封固的标尺，长度为1m或2mm，分为0格或00格,每格的长度为1m（10m)。其目镜测微尺的长度标定方法和细胞显微测量方法如下：1、将镜台测微尺置于载物台的中央（注意刻度面朝上)，用低倍镜调准焦距，进行观察，找到镜台测微尺的刻度。每大格为0。1mm,每小格为001mm。图1 目镜测微尺和镜台测微尺外观形态2、取下目镜的上透镜,将目镜测微尺有刻度的一面朝下,放在镜内的光栏下，再旋上目镜的上透镜。3、从目镜中观察目镜测微尺和镜台测微尺的刻度，转动目镜筒或移动镜台测微尺，使两标尺平行.转换高倍镜,在视野中使目镜测微尺的任一刻度线重合为起点，沿两标尺平行方向，找到另一重合刻度线为终点,记录下其间的格数,就可以算出目镜测微尺每小格的长度.图2 显微测量原理图公式如下：=B/A（m)=目镜测微尺的格数B镜台测微尺的格数L=目镜测微尺每小格的长度4、取下镜台测微尺,换上需测量的玻片标本,记录目镜测微尺所测量的标本的刻度,乘以L，即为标本的长度。三、实验材料 鸡血.四、实验器材 剪刀 玻璃毛细管 载玻片 复式显微镜 目镜测微尺和镜台测微尺五、实验试剂抗凝剂:肝素(5mgml).血细胞稀释液:9%的生理盐水 9 aCl加水至100l.六、实验方法1、每组取1 l鸡血,用生理盐水稀释5倍,制成血涂片（方法见图5），待干燥后，先用甲醇固定23分钟,甩净,待干燥后，滴加姬母萨染液染色1分钟，用流水冲洗。图 血涂片的制备方法、注意将被测的细胞移放到视野的中央。为避免细胞之间的误差，需分别记录五个细胞的数据，取其平均值.、更换不同倍数的物镜或目镜时，需重新标定刻度。、根据测量结果，计算出各种细胞和细胞核的体积及核质指数。椭圆形细胞体积:V=4ab2(a为长半径，b为短半径)核质指数：NP=Vn/（VVn)（Vn为核的体积,V为细胞的体积）七、注意事项、肝素用量要适宜,过少无抗凝作用，过多易导致溶血。2、核质指数是细胞生长状态的一个指标。体细胞的核质比一般是一定的.生长旺盛的细胞的核质比要比一般细胞的核质比小,卵细胞的细胞质多,核质比小。八、实验报告计算鸡红细胞的体积及核质指数。细胞长轴直径细胞短轴直径胞核长轴直径胞核短轴直径细 胞体 积胞 核体 积核 指指 数平均九、思考题、细胞显微测量的原理是什么?2、核质比率的测量有什么意义？3、显微测量有什么用途?实验四动物细胞的传代培养一、实验目的1、熟悉细胞培养过程中的无菌操作技术。2、了解细胞传代培养的基本方法和主要操作步骤二、实验原理细胞培养（cell ure）是指从机体内取出某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程.细胞的体外培养在细胞生物学和医学研究领域有着极为广泛的用途，这一技术已成为研究细胞生理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细胞工程等课题的一项不可缺少的手段。细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供大量的生物性状相同的细胞作为研究对象,便于人们在体外利用各种不同的方法从不同的角度研究细胞生命活动的规律。另外，利用细胞培养技术还可使人们较为方便地研究各种物理、化学和生物因素对细胞结构和功能的影响.细胞培养可分为原代培养和传代培养2种情况。所谓原代培养（priar culture）是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。而传代培养（subuture）是指当原代培养的细胞增殖到一定密度后,将其从原培养容器中取出,以1:2或其他比例转移到另一个或几个容器中所进行的再培养。传代培养可简称传代。在体外培养过程中，要使细胞能正常地生长、繁殖,需经常对其进行传代.传代的累积次数就是细胞的代数.在从事细胞培养工作时常常会接触到细胞系(cell ne）和细胞株（cllstran）这两个容易混淆的概念。一般认为，细胞系指通过原代培养并经传代后所形成的细胞群体,由于细胞系来源于原代培养，而原代培养物中所含的细胞种类较多，故一个细胞系往往由多个生物学性状不同的细胞群体所组成，而细胞株是利用单细胞分离培养法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中选择出的细胞群体,一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或标记并可持续存在。细胞培养是一种程序复杂、条件较多且要求严格的实验性工作.由于细胞在体外的生长、繁殖会受到温度、营养物质、酸碱度、渗透压及微生物等多种因素的显著影响,故细胞培养工作的各个环节如培养器皿清洗消毒、营养液配制和除菌、p值调整、温度调节等操作都有严格的要求和规定，特别要注意无菌操作,这是细胞体外培养成败的关键。三、实验材料人肝癌细胞株pG2四、实验器材CO恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、倒置相差显微镜、电热高压蒸汽消毒锅、细胞培养瓶、表面皿、培养皿、吸管、除菌滤器、小烧杯、100ml玻璃试剂瓶、橡皮瓶塞、酒精灯、记号笔。五、实验试剂MEM培养液:用天平称取DMEM培养基粉剂（质量依实验所需培养液的总量而定）倒入烧杯中,按说明书要求加入三蒸水、aHCO3、谷氨酰胺，利用磁力搅拌器使加入的固体物完全溶解，然后加入适量浓度为2000单位ml的青霉素和链霉素，使培养液中这两种抗菌素的浓度分别达到100单位/m。再按比例加入胎牛血清,使其在培养液中的含量达到20，将溶液充分混匀,用5%的NaHCO和1M的HC调培养液的pH值至7.。最后用G或G6型玻璃除菌滤器负压抽滤除菌。2PS（不含钙镁,pH。2)：分别称取NCl 8.0g、Kl 0.0g、NaPO4、1g、KH2P 0。0g，加三蒸水溶解并定容至100ml。3.Dnks液；D-Hnk原液：分别称取Na 8g、a2HO4.H0。6g、K .0g、KH2O4 .6、Na0 .5g,加三蒸水溶解至l0ml。配制时要注意按顺序逐一加入溶解，应等前一种药品完全溶解后再加下一种药品，原液配好后应分装于250ml或0ml玻璃瓶中，高压灭菌,置冰箱内贮存。DHaks工作液:取DHank原液l0m,加三蒸水96m，再加05的酚红溶液4ml混合均匀即成.4。02胰蛋白酶(pH。27。6)：称取活性为1:20的胰蛋白酶.5g，另准备DHans工作液0l。先用少量Haks工作液将胰蛋白酶粉调成糊状，再将剩余的Dank工作液全部加入，充分搅拌使酶充分溶解，必要时可将容器置于36恒温水浴箱中，直至酶液清亮,再用NaHC调至72-.6。然后用玻璃滤器除菌,分装于灭菌后的EP管中，密封后置冰箱冷冻室(8)中贮存。六、实验方法（一）实验过程中无菌操作的要求1。培养用品的清洗消毒：实验中所需的玻璃器皿（如培养瓶、离心管、吸管、小瓶等)和器械(如剪刀、镊子等）应彻底清洗干净，干燥后用牛皮纸包好置高压蒸汽消毒锅中消毒灭菌（蒸汽压力为103ka,0min)。而培养液、B液、胰蛋白酶液、BS液等应利用抽滤法除菌。将已消好毒的实验所需物品收集并清点好置于超净工作台内，避免实验开始后再从工作台外取物而受污染。为操作时方便,工作台内的用品应合理布局，原则是右手使用方便的用品放在右侧,左手使用方便的用品放在左侧,酒精灯放在中央。2超净工作台的消毒:超净工作台在使用前可用酒精纱布将其内部揩擦一变进行初步消毒，然后打开工作台内的紫外线灯照射消毒2030min.照射杀菌完毕后关闭紫外线灯并同时打开风机，由于进入工作台内的空气是经过工作台上的除菌滤板过滤的,故工作台内是一个相对无菌的环境。3手的消毒:操作时双手及前臂要伸入超净工作台内,事先双手必须用肥皂刷洗干净，然后用75的酒精棉球擦拭消毒.在夏季，手的刷洗和消毒应至肘部;在冬季，双手消毒后进入工作台前应戴上无菌的袖套。4操作过程中的消毒:在超净工作台中开始操作时首先应点燃酒精灯，此后的一切操作如打开或加盖瓶塞、安装吸管皮头、使用吸管、使用各种金属器械等均要经酒精灯的火焰烧灼或在火焰旁边进行操作。培养操作时,动作要准确教捷，不能用手触及器皿的消毒部分，如不慎触及,要用火焰消毒或更换。开盖的培养液或培养用瓶应尽量保持斜位放置或平放,以避免瓶口长时间直立而增加细菌污染的机会.吸取不同液体时应分别使用不同的吸管,不要混用以防扩大污染。（二)细胞的传代培养当培养瓶中的细胞已长成致密单层时即可进行传代培养，其操作步骤如下.1.准备:将所需培养用具清洗消毒后放入超净工作台内并摆好，紫外线消毒30mn.将已形成致密单层细胞的培养瓶从培养箱中取出放入超净工作台中。点燃酒精灯,在酒精灯旁将培养液倒入一小烧杯中。消化:向培养瓶中加入消化液（02的胰蛋白酶)50l，轻摇培养瓶,使消化液湿润整个细胞单层,置室温下2-3m。翻转培养瓶使其底部朝上，用肉眼察看细胞单层，如细胞单层上出现空隙(约针孔大小）时即可倒去消化液；如果末见空隙，说明消化程度不够，可将消化时间稍延长；如果发现细胞已大片脱落,说明已消化过，在这种情况下不能倒出消化液，而应直接进入下步操作。3.终止消化:往培养瓶中加入3。5ml培养液以终止胰蛋白酶的消化作用，用吸管吸取瓶中的培养液反复冲击瓶壁上的细胞,直至全部细胞被冲下,轻轻混匀制成细胞悬液.计数：吸取少量细胞悬液于细胞计数器的小室中，光镜下计数，根据结果将细胞浓度调整至5105/m1(细胞接种的密度亦可根据经验进行)。传代:吸取2l细胞悬液移入另一培养瓶中,原培养瓶中留下2l细胞悬液（其余弃去），并向每瓶中加入新培养液4m，盖好瓶塞,轻轻摇匀后置37恒温箱中培养。6.观察:传代后每天应对培养的细胞进行观察,若细胞贴壁存活则称为传了一代，如培养液变酸发黄要及时更换。七、注意事项在整个细胞体外培养过程中，要始终保持无菌的概念，在操作的众多环节中要注意消毒灭菌,努力做到最大限度的无菌,严防细菌的污染,否则将导致细胞培养的失败。八、实验报告写出细胞传代培养的实验记录。并记录传代培养后的贴壁细胞的生长情况.九、思考1在细胞培养过程中，培养液的颜色为什么会变黄？2。在细胞培养的过程中避免污染的关键环节有哪些？实验五中等纤维免疫荧光染色定位观察一、实验目的掌握细胞免疫荧光染色法的原理2.了解荧光显微镜的使用方法二、实验原理真核生物细胞质中的骨架纤维，按其直径、组成成分及分布特征可分为微管、微丝和中等纤维三种骨架纤维.中等纤维具有组织特异性，不同类型细胞含有不同的中等纤维蛋白。其中，波形纤维蛋白(Vimnin)分子量约5D,广泛存在于间充质细胞及中胚层来源的细胞中。波形蛋白一端与核膜相连,另一端与细胞表面处的桥粒或半桥粒相连，将细胞核和细胞器维持在特定的空间.间接免疫荧光染色是观察细胞成分定位及其分布的一种特异性和灵敏度较高的方法，常用来观察细胞骨架及细胞外基质，其染色的基本原理为：间接免疫荧光染色法有两对抗原抗体系统;第一对是欲测抗原及其相应未标记抗体(一抗),第二对是免疫球蛋白及其相应标记荧光色素的抗免疫球蛋白抗体(二抗），由于免疫球蛋白分子上有多个抗原决定簇，因而能结合多个荧光素标记的抗免疫球蛋白抗体分子。所以，间接免疫荧光染色法的灵敏度较高，是一种观察抗原定位及其分布的常用方法。图 间接免疫荧光染色原理三、实验材料体外培养的人肝癌HepG2细胞株。四、实验器材荧光显微镜,超净工作台，CO2培养箱，倒置显微镜,冰箱，温箱,滴管，吸管，离心机，移液管，3m培养皿，试管架,20l微量加样器，湿盒，载玻片,盖玻片,滤纸.五、实验试剂B溶液 p。2，甲醇，丙酮,PB溶液，抗荧光淬灭剂DACO，细胞核染料AP，封闭用马血清。抗体:抗波形纤维蛋白抗体，荧光素标记的二抗。抗体使用前用PBS进行适当稀释。六、实验方法取出生长有单层培养细胞的盖玻片，放入含有PBS溶液的小培养皿中漂洗,以洗去培养液。用滤纸吸去盖玻片上多余的PBS。2盖玻片移入盛有冷甲醇（20）的小培养皿中固定0m(放入-20）.使片上的细胞固定.。取出盖玻片，滤纸吸去多余甲醇后放入冷丙酮（）小培养皿内5-10min。主要抽提膜脂，在膜上打孔，使抗体能够进入细胞.4取出盖玻片，吸去多余丙酮.PB溶液中过一下，吸去多余PS，将载片细胞面向上平放在湿盒中，用微量加样器滴加马血清，置于37温箱中温育3in。5取出盖玻片，滤纸吸去马血清，BS溶液中过一下,吸去多余PBS,将载片细胞面向上平放在湿盒中,用微量加样器滴加稀释好的30l波形纤维蛋白一抗溶液,盖好湿盒，置于3温箱中温育30-60mn.6取出盖玻片,滤纸吸去一抗液，用PBS溶液中洗涤次，每次5min，以吸去未结合的抗体。7。滤纸吸去残留的PBS溶液,再次放入湿盒，加荧光素标记的二抗0l,置于7温箱中避光温育30-6min。8用滤纸吸干二抗液，用S溶液洗涤次，每次mi。9.于盖玻片上滴加3lDAPI，于室温中孵育-8min。.用滤纸吸干DAI，用PBS溶液洗涤3次,每次5mn.1。滴1滴封片剂（甘油：PBS=：1）于载玻片上，将盖玻片有细胞面朝下盖封片,防止产生气泡。12观察结果(如不能及时观察，将制成的细胞片子置于-可以保存1-个月）。七、注意事项1制片后尽快观察,以免染色的荧光衰退.固定时需保持低温，以保持抗原的完整性。3.所用试剂须新鲜配制。八、实验报告对免疫荧光染色后细胞中中等纤维的分布情况进行描述。并进行讨论。实验六 考马斯亮蓝R20染色法观察微丝一、目的掌握观察动物细胞内微丝的方法：考马斯亮蓝R250染色法二、原理真核细胞胞质中有错综复杂的纤维网,称为细胞骨架。根据纤维的直径分为微丝，微管和中间纤维。此外,还散布着一些比微丝还细的纤维.本实验观察的是由微丝平行排列组成的纤维束，在动物细胞里称作”应力纤维”应力纤维在体外培养的贴壁细胞中尤其发达。一般当细胞充分铺展时,经考马斯亮蓝R250染色，可看到沿细胞长轴伸展的粗大纤维束，此即应力纤维。三、仪器光学显微镜,温箱，细胞培养设备四、实验材料平皿，载玻片，盖玻片，体外培养的贴壁细胞五、试剂1、细胞培养基2、磷酸缓冲液（PBS,PH。4）3、0。2ml/L磷酸盐缓冲液（PH 7.3）;（1)A液:0。mol/L的H2PO；称取NaH2PO4。HO3.2g(或 2PHO 7.6g)加重蒸水至1000ml溶解。(2)B液:0.2mol/L的 a2HO4：称取Na2HPO4.12H2 1.63(或 NHO47H2O 53。6或aPO42H2O 35。6g）加重蒸水至00ml溶解。（3)0.2o/L pH。3的磷酸盐缓冲液的配制:约取8mlA液和2ml B液,充分混合即为0.2ol/L的磷酸盐缓冲液。若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。、M-缓冲液（pH7.)终浓度用量咪唑(0mol/L）3.44gC（50mmo/L)3.gMgCl2（0。5mmol/L)0。101gGTA（10mmol/L）0.80gDA(0。1mmol/）0029巯基乙醇（1mmol/L）0.l甘油(4mo/L）ml用1mol/的盐酸调节至H7.，蒸馏水加至00ml,室温保存备用 .5、1riton-1（用M-缓冲液配)6、0。2考马斯亮蓝R2507、0戊二醛(用2ml/L磷酸盐缓冲液配制）。六、实验步骤1.细胞培养在平皿中的盖玻片上,尚未致密时即可使用。取出盖玻片,用PS洗涤3次。2。用1ritn-10处理25-30m,室温或37均可。立即用缓冲液轻轻洗细胞3次。略晾干后，用3。0%戊二醛固定细胞515mi。5.PBS洗数次，滤纸吸干.6。用0。2考马斯亮蓝R250染片子1.然后小心用水冲洗,蒸馏水冲洗，空气中略干燥。7普通光学显微镜下用40物镜或油镜观察，应力纤维成深蓝色。七、注意事项.洗片时要轻柔，以免把细胞从载片上洗去。2。细胞盖片注意正反面。3染色后应冲洗盖片背面,避免损伤细胞.八、实验报告1。画出你所观察到的微丝图像。2。对实验成功失败的原因进行讨论。九、思考题、微丝观察实验中, Trton100处理细胞的作用是什么？此实验是否能看到微管，中间纤维?为什么？、缓冲液的作用是什么?实验七：液泡系和线粒体的活体染色一、实验目的1、掌握线粒体和液泡系的活体染色方法。2、了解光镜下线粒体和液泡系的基本形态、结构。二、实验原理(一）液泡系的活体染色液泡系(cuome)是细胞内一种重要的细胞器，它普遍存在于动植物细胞.动物细胞液泡系是法国学者M.ra继Dageard发现植物细胞液泡系之后于1924年首次发现的。在一切动物细胞内皆有。通常为圆形泡状,有极性,数目多少不定,液泡系皆集中在细胞核的顶部上方，位于细胞的中央部分。液泡是细胞内浓缩产品的重要场所,有十分重要的生理功能.动物细胞内的液泡系因为很小，如果不经过活体染色，就很难显示出来。在有些细胞(如胰腺细胞)可用相差显微镜观察到液泡系。根据中性红活体染色的结果，可知液泡系分为大、中、小三种类型的液泡.小液泡被中性红染成均匀一致的深红色，即为“含浆液泡”（Vacuols plasmoccrins）。经中性红染色后呈橙红色，有的边缘呈深红色新月形或环形，这是中等的“含分泌粒液泡(Vacuole hgorin).含有成熟分泌颗粒的大液泡因已全部蛋白质化，所以不再被中性红染色，只有液泡的残余部分（新月形或环形）被染成红色。中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡染成红色，在细胞处于生活状态时,细胞质及核不被染色。如果细胞死亡，细胞质及细胞核才被中性红染成弥散的红色.此时,液泡染色消失,液泡开始毁坏。为了保证观察材料处于生活状态，要求一定的细胞环境条件适宜的温度、渗透压、pH值、营养成分等.因此观察时室温不要过高或过低,显微镜要有必要的滤热装置。细胞材料要浸泡在生理盐水中。长期观察还要注意防止因生理盐水蒸发而改变渗透压,并供给所需的养分等.（二）线粒体的活体染色活体染色是利用某些无毒或毒性较小的染色剂显示出细胞内某些天然构造存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以至引起细胞死亡的一种染色方法。线粒体是动物和植物细胞内均有的，一个重要的能量细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所.细胞各项活动所需的能量,主要是通过线粒体的呼吸作用来提供的。詹纳斯绿是线粒体的专一活体染色剂，其毒性较小。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而周围的细胞质中的染料被还原成为无色状态。三、实验材料1、小麦根尖四、实验器材1、复式显微镜（10、40及油镜头）、擦镜纸、香柏油、二甲苯。2、双面刀片、剪刀、镊子（尖头、平头)、解剖盘.、小平皿、吸管、牙签、酒精棉.、载片、盖片、吸水纸。五、实验试剂（)Rngr氏液：NaC 0.9gCl .04gCal2 0025加蒸馏水至00ml。(2）1/0詹纳斯绿(Jnsgree）染液：A1%詹纳斯绿染液（储备液）： 詹纳斯绿 5gRinge氏液 0lB.1/300詹纳斯绿染液（现用现配，以保持其氧化能力):1%詹纳斯绿染液(储备液) 1mlier氏液 2l（3）1/3000中性红染液：A、储备液：中性红 0.蒸馏水 100ml 黑纸包好后于冰箱保存.B、工作液:储备液1m加蒸馏水2，即成1/300中性红染液（工作液）.六、实验方法（一）植物细胞液泡系中性红染色及观察1、用双面刀片把初生的小麦幼根根尖(约12m长)，小心切一小段；2、放在载玻片中央的/3000中性红染液中，染色1015分钟;3、用吸管吸去中性红染液,滴加一滴inger氏液，加盖片，镜检。4、镜下观察，可见在每个生长点细胞内有很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形液泡。如果观察已经分化长大的细胞，可看到较大的液泡，数目少,有时只有一个巨大的浅红色液泡。(二)人口腔粘膜上皮细胞线粒体詹纳斯绿 活体染色及观察、用牙签刮下口腔粘膜上皮细胞，涂于载玻片上;2、滴加1/3000詹纳斯绿染液,室温下染10分钟；、覆以盖玻片，盖玻片下两侧可放头发丝支撑，使不压迫细胞并贮存较多染液，如观察时间较长可适当添加染液。七、注意事项1、要保证小麦根尖的完整性，不要弄破表皮，否则其内部会全部染成红色,看不到液泡系。八、实验报告1. 简述液泡系中性红活体染色的原理，并绘图示植物细胞液泡系。2. 简述线粒体詹纳斯绿活体染色的原理,并绘图示人口腔粘膜上皮细胞线粒体詹纳斯绿活体染色图。九、思考题1、詹纳斯绿是线粒体特异性染色剂，其染色原理是什么？2、线粒体结构如何，其具有那些功能？文中如有不足，请您指教！13 / 13