线粒体基因组结构与疾病mitochondria.ppt

线粒体基因组结构与疾病,高国全 中山大学中山医学院生化系 020-87332128 2009-10-10,绪论 线粒体的功能：真核细胞的重要细胞器，能量转换系统或细胞动力站 线粒体的发现及其研究：,1894年，Altmann用显微镜观察到动物细胞中存在颗粒状，杆状结构，命名为生命小体，认为系细菌共生于细胞内产生（内共生假说） 1897年，Benda将其命名为线粒体（mitochondrion） 1900年，Michacles用Janus green B染色细胞，发现Mt可借氧化还原反应使染料变色，提出Mt是细胞氧化的场所。,1946年 Claude用差速离心法获得线粒体组分。 1950年，Schneider和Hogeboom用蔗糖密度梯度离心法分离得到Mt细胞器。,1952年，Palad和Sjostrand用电镜观察到Mt超微结构。 1948年Green证明了Mt含有全部三羧循环的酶。 1949年，Kennedy和Lehninger发现脂肪酸的氧化在线粒体进行。,1965年，Racher证实线粒体内膜突出的球形颗粒为ATP合酶。 1976年，Hatcfi纯化了呼吸链四个独立的复合体，明确了Mt内膜的酶系组成。,1980年，Mitchell提出了氧化磷酸化偶联的化学渗透学说（chemiosmotic theory）。 1963年，Nass观察到线粒体内存在DNA分子，随后发现线粒体具备自主遗传信息传递的酶类，如DNA聚合酶、RNA聚合酶、核蛋白酶、氨基酸活化酶等。,1981年，Anderson完成了人类线粒体基因组全部序列的测定。 1986年，Chomyn等明确了mtDNA编码的所有基因及其定位。,1988年，Holt发表文章证实mt DNA缺失与线粒体肌病的关系；Wallace发表文章证实mt DNA错义突变与Lebers 母系遗传性视神经病变（LHON）的关系。由此提出了“线粒体DNA病”（mitochondrial DNA diseases)的概念。研究发现mt DNA异常与许多重大疾病相关，比如心脏病、糖尿病、早老性痴呆（Alzheimers Diseases）、帕金森氏病（Parkinsons Diseases）和衰老（ageing）。, 1 Mt 的形态结构 一、形态、数目和分布 形态：多种多样，常见线状、颗粒状。 数目：每个细胞内含Mt数目差异很大，需能多的细胞数目多。 分布：位于需能较多的部位,二、结构 Mt 的电子显微镜超微结构（ see next page） 内膜 外膜 嵴和基粒 基质：各种生物氧化的酶，mt DNA和其他信息分子,三、再生和起源 1. 再生：重新合成 起源于非Mt结构 现存线粒体的分裂：同位素Mt膜标记实验证实该学说。 2. 起源： 内共生假说及存在问题 分化假说及存在问题, 2 Mit 基因组结构与遗传信息传递 1963、64年发现 mt DNA 1981年，人、小鼠 mt DNA全序列测定 1989年，大鼠 mt DNA全序列测定 研究DNA结构及信息传递的良好模型MW 小，较易纯化,一、mt DNA基因组结构 裸露的闭合环状DNA分子，占细胞总DNA的1% 人全长16569 bp（14-18kb） 不与组蛋白结合，不含内含子 由重链（H）和轻链（L）二链组成，H富含嘌呤，L富含嘧啶，密度离心分为两条带而得名,编码37个基因：22个tRNA编码基因 2个rRNA编码基因 13个多肽基因： 复合体I （NADH-CoQ氧化还原酶，ND ）中7个基因， ND 1，2，3，4，4L, 5，6 复合体IV （cyt 氧化酶，CO ） CO -I，II，III三个基因 复合体III中的一个亚基cyt b 复合体V 中Fo二个亚基ATPase 6，ATPase 8,二、mt DNA 复制 半保留方式同核基因组，但不局限在S期 只有一个复制起始点和原核生物一致（质粒一个复制起始点，但为双向复制） OH位于D环区（12点至1点之间），顺时针复制，循环一周，DNA聚合酶为核基因编码 OL位于9点，当H链复制到此处时，开始复制，逆时循环一周, 复制时间 ：2小时,三、mt DNA转录 只有一个共同的启动子，位于D环区与核基因不同 HSP和LSP分别启动各自链的转录 HSP1 生成两个r RNA，tRNA phe、tRNA val HSP2生成其他tRNA和mRNA, 转录含有一条DNA链的全长拷贝 转录生成后在限制性内切酶作用下，裂解成rRNA、tRNA和mRNA，不含信息的其余90%很快被分解。 转录后加工： tRNA -CCA尾；mRNA -polyA尾 mRNA 5端无帽子结构 基因无内含子，mRNA不需剪接（低等酵母有内含子), 线粒体转录因子（mTF1）：增强RNA聚合酶对启动区域序列的辨认。 线粒体转录终止因子（mTERF）：结合在16s rRNA基因和tRNA leu基因之间，阻断HSP1启动的转录，而对HSP2无效。,四、mt 蛋白质合成 所有RNA，均由mt DNA编码，无 RNA输入 Pr合成在mt独有的55s核糖体上进行，并形成多聚体,28s 39s,12s 16s rRNA, mt遗传密码表与通用密码表不同见书表 22种tRNA（细胞质中存在32种），反密码子与密码子配对不严格 Pr合成体系与原核细菌相似： 由N-甲酰蛋氨酸tRNA起始 放线菌酮抑制胞质蛋白合成，不抑制mt和细菌 氯霉素抑制细菌和mt蛋白合成，不抑制胞质蛋白合 成 转录、翻译紧密连接：多聚核糖体与DNA相连（二者均在mt基质内，无核结构分隔）,五、mt 的半自主性 半自主性：只能合成自身需求的蛋白质等物质的一部分 多数由核基因编码，在胞质合成然后转入Mt Mt复制、转录、翻译对核基因有一定的依赖性，受到核基因的控制。,细胞质中蛋白质输入线粒体 组成 mt蛋白质来源 小部分由mt DNA编码 大部分由核DNA编码，合成之后输入mt 由核基因编码的mt蛋白质见下表,-, 蛋白质输入线粒体过程中需要的重要成分 蛋白质前体（precursor）分子中的导肽（presequences） 通常位于前体分子的N末端，约20到80氨基酸。 导肽分子内含有靶向信号（targeting signal）负责靶向和辨认线粒体膜受体；有的导肽分子中在靶向信号下游尚含定位信号（localization signal），决定蛋白质分子在线粒体中的具体定位，如内膜、膜间腔等）, 导肽的氨基酸组成 ： 富含带正电荷的碱性氨基酸，有助于于和mt表面受体结合并进入带负电荷的mt基质 富含羟基氨基酸，如丝氨酸 缺乏或少见酸性氨基酸 此种氨基酸组成有利于形成双亲性的螺旋结构，有利于穿过mt外膜脂质双分子层, 少数多肽没有可切除导肽：如ADP/ATP carrier （AAC），其定位信号位于三个同源片段的C末端，将其定位于内膜；外膜孔蛋白没有可切除导肽，但在N端有定位信号；位于膜间隙的cyt C没有导肽，尚不清楚其定位信号。, 受体 蛋白前体输入mt，首先与mt外膜表面的受体相结合 受体类型： MOM19和MOM72（moitochondrial outer membrane，MOM）从粗糙脉孢菌（neurospore crassa）中分离出来,MOM19能与大多数具有导肽的前体蛋白识别与结合，是主要的受体蛋白质，用抗MOM19抗体阻断MOM19，线粒体四个亚区（外膜、膜间隙、内膜和基质）的蛋白输入均受抑制。MOM19均匀分布在整个mt外膜表面 MOM72定位与MOM19相似，位于外膜，N-末端疏水序列锚定于外膜，其余部分亲水片段游离于胞液中。MOM72能与不含可切除导肽的蛋白质分子特异性结合。,MAS20和MAS70（mitochondrial assembly，MAS）从酵母中分离得到，其结构和功能与MOM19和MOM72相同。 受体间可形成复合体：如 MAS37-MAS70亚复合体 MAS20-MAS22亚复合体 两种亚复合体可形成四聚体复合体，与前体分子的不同区域结合。, 共同输入通道（common import site ，channel，pore or general insertion protein， GIP ） 与受体结合的前体蛋白最终经共同输入通道进入mt，MOM38（酵母ISP42）是外膜输入通道蛋白质 广义的受体复合物包括受体蛋白和GIP，或称receptor-GIP复合体, 转位接触点 （translocation contact site ，membrane adhesion site） 当蛋白质前体进入mt时，从mt 外膜、内膜之间接触点插入，外膜受体和输入通道位于或接近于接触点处。, 内膜蛋白质输入装置 主要由MIM17，23和44构成 MIM17，23形成通道 MIM44（酵母ISP45）和mit-Hsp 70合作起转位作用将蛋白质推进至基质 前体蛋白质进入内膜需要ATP和膜电位 , 分子伴侣（molecular chaperones） 分子伴侣介导多肽链形成正确的组装和空间构象，但它们本身并不参与最终构象的组成。分子伴侣大多数是热休克蛋白（heat shock protein，HSP）, mt蛋白质输入过程中分子伴侣起重要作用：导肽转位；蛋白质前体胞液片段解折叠；蛋白前体跨膜运动；新输入的蛋白质在mt基质中重新折叠成自然构象。 参与mt蛋白质输送过程的HSP主要是ct-HSP70和mt-HSP70。ct-HSP70具有解折叠酶活性，防止新生肽链的结合，聚积；mt-HSP70在肽链未进入mt基质前维持蛋白质的解折叠状态，推进多肽链进入基质；进入基质后，mt-HSP70具有使多肽链重新折叠成正确构象的作用。, 新输入的蛋白质加工过程 mt基质加工肽酶（matrix processing peptidase）：切除导肽 加工肽酶激酶（processing-enhancing protein，PEP）：可提高MPP活性至50倍 基质中间肽酶（matrix intermediate peptidase，MIP）：切除第二段导肽 内膜蛋白酶I（inner membrane peptidase I）：切除位于膜间隙和内膜的蛋白质前体第二段导肽,线粒体蛋白质输入过程中的重要分子（图示）, 3 Mt 基因组结构异常与疾病 线粒体病： mt异常影响细胞能量供应，从而影响细胞的正常功能，所致疾病称为线粒体病（mitochondrial diseases）。常累及脑、肌肉和眼等对能量需求较高的组织和器官。 线粒体DNA病：mt病的研究已从mt的形态功能变化进入到分子水平，mt 基因组（DNA）结构的异常所导致的疾病，或相关疾病称为线粒体DNA病。,一、mt DNA结构异常的主要类型 mt DNA易受损伤：无组蛋白和DNA结合蛋白的保护；复制快速但无校读功能（proof-reading）；缺乏修复机制；mt DNA突变率较核DNA高17倍 干细胞mt DNA异常导致家族性疾病；体细胞mt DNA异常导致散发性疾病和年龄相关性疾病。, 类型：点突变：（编码基因：结构基因、tRNA和rRNA基因；非编码区） 缺失： 缺失类型多样，最常见是4997bp（5kb普通缺失）。 插入重复（insertions and duplication）：mt DNA上插入一段核苷酸片段形成mt DNA基因序列的重复。,二、mt DNA异常所致的经典疾病线粒体肌病（mitochondrial myopathy）,三、mt DNA异常与衰老和神经退行性疾病 1. Mt DNA异常与衰老 衰老的自由基学说 氧自由基积累mt DNA损伤，超过一定阈值（threshold）细胞中线粒体结构、功能退化细胞OXPHS（oxidative phosphorylation）能力下降，ATP生成减少细胞衰老或死亡，主要累及代谢旺盛器官：脑、肌肉、心脏等。,2. Mt DNA结构异常随年龄而增加 常见缺失突变，以4977bp和7436bp最常见，mt DNA缺失发生年龄随受累组织和缺失类型而异。 点突变报道较少，mt DNA 3243AG突变，成人较婴儿高510倍。, 1999年，Michikawa等发现mt DNA调控区（D-loop和相临的转录启动序列）存在衰老相关特异性的点突变，几乎均为碱基的替换，如285TC，368AG，383I（插入）和414TG，在14例年龄超过65岁的老人中发现10例具有上述点突变，而在13例青年中未发现一例具有上述点突变。该特异性点突变的频率（即含突变mtDNA占总mtDNA的比例）约为20%。（Science，286：774-779，1999）。,2. Mt DNA异常与神经退行性疾病 Alzheimers disease： 老年始发的神经退行性疾病，为西方老年人的第四位死因，表现为记忆缺失（amnesia）、失语（aphasia）和失认（agnosia）三A症状。 病理学特征：脑中出现老年斑（senile plaques ，SP）和神纤维缠结（neuropathological tangles ，NFT）。, 相关基因：, Mt DNA变化 点突变 ND2基因 5460 GA or T（实验未能重复） ND1 3397 AG tRNA gln 4336 AG（conflicting results） Asn 5705 TG 16s rRNA 3196 GA mt CoI，CoII（missense mutations）late-onset AD（contamination nDNA） 缺失 AD病人75岁 5 kb 缺失较对照组降低 老年性记忆减退动物模型较记忆正常组，mtDNA 5kb缺失比例增高。, Parkinsons disease（PD）： 另一种常见的老年性神经退行性疾病，又名震颤麻痹，以运动减少，肌肉强直和震颤为主要症状。主要病理变化是位于脑黑质的DA神经元变性和消失。 PD病人脑黑质的mt复合物I活性降低39%，IIIV活性正常，其小分子量亚单位降低，具体分子机制尚不明确。,PD病人脑mt DNA5kb缺失较对照组无增加 在PD病人脑中发现和AD相似的点突变,但mt DNA全序列分析，PD病人和相同年龄对照组之间这些突变的频率没有明显差异（B.B.R.C, 290：1593601，2002） 最新研究发现PD易感基因，NR4A2，其编码一组核受体超家族，是黑质多巴胺神经元再生和分化的必要因子。,在家族性PD病人中（10/107例）发现NR4A2基因两种突变（291Tdel和245T G）；而在散发性PD病人（94例）和年龄相对应的对照组（221例）中均未检测到这种突变。 此种突变导致了NR4A2 mRNA水平显著下降且影响酪氨酸羟化酶的转录，因而可产生多巴胺能神经元的功能异常，和PD相关。 由于该突变仅发生在家族性PD病人中且比例不高，其可否定义为PD的易感基因尚不成熟。（Nat Genet，33（1）：85-9，2003）,四、mt DNA缺陷相关疾病的基因治疗 mtDNA缺陷病的药物治疗效果不理想，需从根本上进行纠正。 基因治疗的途径:,线粒体外基因代偿性表达：mt外表达然后导入mt内替代缺陷基因产物，已有成功的先例 缺陷：mt DNA和核基因遗传密码不同 tRNA不能导入，mtDNA重组难于校正， 需加入正确的导肽序列, 线粒体内基因代偿表达：将突变基因的正常 拷贝转入mt并表达 导肽 DNA片段嵌合体将基因导入mt 顺式互补 野生性拷贝替换突变基因（重 组修复） 反式互补 野生性拷贝在mt内自主表达达到表型补救。, 异质性缺陷mt突变基因的去除 异质性：野生型/突变型并存 能阈：突变型百分率超过一定阈值，表现出临床症状 反义技术/RNAi等方法特异性阻断mt突变型基因的复制，野生型含量不断提高，突变型比例下降，mt 氧化还原能力恢复到阈值以上，生物功能得以恢复，而不需要完全消除突变的mt DNA ）。,