胚胎试验在水生动物中的应用.ppt

胚胎试验在水生动物中的应用,李康 2004.11.12,建立灵敏、简便易行的检测方法,急性暴露试验虽然简便易行，但是其检测指标过于简单。 各种慢性毒性试验虽然提供多个检测终点，但存在实验周期长、费用高等不足。 而水生生物胚胎试验具有成本低、影响因素少、灵敏度高等方面的优势，受试物种也由最初的鱼类向多样化发展，其应用日益广泛。,鱼类成体和胚胎试验灵敏度比较,胚胎试验,胚胎试验是又称胚胎毒性试验或胚胎致畸试验，指通过把胚胎暴露于受试化学物质而受到毒害作用，继而影响胚胎的发育、导致胚胎发育停滞或胚胎畸形。 广义上的胚胎试验包括所有以胚胎为材料的生物学试验，其内容涵盖形态学、发育学、毒理学、行为学等方面 。,鱼类,鱼类因具有繁殖力高、体外产卵、体外受精等生殖特性成为胚胎试验的最主要材料。,用于胚胎试验的一些种类,斑马鱼,在实验室内对单一物质的毒性评价往往使用特定的种类，斑马鱼是其中一个重要代表。欧洲和美国都有已经建立的标准方法。,Zebrafish (Danio rerio),甲壳类 草虾,草虾属广盐性甲壳动物 (3-31ppt)。 分布广(遍布美国东海岸和墨西哥湾的广大河口)。 个体小，只要水温，光照条件适宜，成体在实验室容易繁殖，只需分离不同发育阶段的胚胎即可用于试验。 尽管雌体产卵后抱卵于腹部直至孵化，胚胎离体后同样可以正常发育至孵化， 卵外被膜、胚胎透明而易于观察形态异常。,Grass shrimp (Palaemonetes pugio),Grass shrimp (Palaemonetes pugio),其它动物,The Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus (FETAX) 爪蟾 ASTM E 1563-98: Standard guide for Conducting Static Acute toscicity Tests with Echinoid Embryos 海胆,Medaka (Oryzias latipes),Blue crab (Callinectes sapidus),试验动物的选取,被广泛利用 在实验室内容易大量培养 具有代表性和对受试物的敏感性 遗传背景清楚 试验动物的饲养也有相应的规范,胚胎来源,多数鱼类产卵后离体孵化，易于收集 。 一般可采用亲鱼人工催产结合人工受精的方法获得 。 对于如斑马鱼，青鳉等小型种类，在实验室内养殖相对容易，只需控制适当的物理条件，一般都能在试验当天取到足够数量的受精卵 。,野外试验,收集鱼卵 在实验室完成剩余的发育过程，检测多个终点指标 。 原位暴露 在室内得到受精卵，用适当的装置放置于待检测的地点，全部发育过程或绝大部分发育过程在野外完成。 有抱卵习性的甲壳动物，胚胎在母体腹部附肢发育成幼体，通过捕捞带卵的母体，分离胚胎。,分类,胚胎试验同样可分成急性毒性试验和亚急性毒性试验 。 急性毒性试验时间较短，其目的是获得有关受试物的初步毒性信息；亚急性毒性试验时间较长，可以贯穿胚胎发育的整个时期。 暴露途径 可分为静态，半静态和流动等 ，或微注射的途径。,容器,透明的试验容器通常是首选，烧杯、培养皿、培养管是最普通的工具。 在野外暴露试验中，有黏性的受精卵可以被直接负在载玻片上，后者固定在特制的容器里 。,溶剂,有机物质水溶性较差，则需要化学溶剂来助溶，但不适当的溶剂会影响结果的可靠性，化学溶剂本身对胚胎具有毒性甚至会和受试物产生协同作用，因此，选用适当的溶剂以及适当的浓度对结果的准确性都是有益的。 乙醇，丙酮，二甲亚砜是常用的溶剂，终浓度一般在0.1%以下 。,0.5%(V/V)乙醇,1%(V/V)乙醇,对照,Grass shrimp (Palaemonetes pugio),检测终点,半致死浓度（LC50） 形态异常 孵化延迟 生化指标 遗传物质 生长指标,半致死浓度（LC50）,半致死浓度（LC50） 死亡是检测的可见终点，初步反映受试物的毒性，是急性毒性试验的常用指标 。 孵化也可作为终点来反映受试物毒性，指标采用半效应浓度（EC50）。 在发育早期可以胚胎完整性来判断存活与否，当器官出现后则用器官的运动作为标准。,形态异常,形态异常是胚胎致畸试验的核心内容 。 斑马鱼和爪蟾胚胎发育过程中有多种可以观察的反应指标，被列入标准方法的观察终点。 对于甲壳动物，常见的观察结构有眼、卵黄形状、心脏、头部、肝胰腺 。 发育异常往往会导致导致终止发育或发育延迟，进而推迟孵化时间。,B = brain; C = chorda; Ch =chorion; E = ear; Ed = edema; Eud = ear underdeveloped; Ey = eye; Eyud= eye underdeveloped; NC = negative control; Tnd = tail not detached;woEy = without eyes; woH = without head; woS = without somites,Catfish (Clarias gariepinus),对照,Cd 和Cu,1%(V/V)乙醇,对照,Grass shrimp (Palaemonetes pugio),孵化延迟,Grass shrimp (Palaemonetes pugio),生化指标,随着胚胎发育的深入，器官逐渐建成，一些酶活性也显示出来，在暴露条件下酶活性的改变也可作为检测终点；受试物既可抑制酶活性，也可使一些酶出现应激性增强 。,Grass shrimp (Palaemonetes pugio),受试物及其代谢物还可能对遗传物质产生影响,Grass shrimp (Palaemonetes pugio),生长指标,Catfish (Clarias gariepinus),Pacfic herring (Clupea pallasi),应用现状,单一化学品毒性 环境检测项目 检测土壤、沉积物污染 。 石油降解产物；溢油事件的生态恢复研究 。 混合性工业生产废水，生活污水的毒性，特别是致畸效应，被用于探讨遗传毒性。,发展前景,尽管胚胎试验有着高重复性的优点，但试验材料和检测指标的选取都会影响到试验的结果。不同发育阶段的材料应选取适当的指标，因不同发育阶段的胚胎对同一毒物具有不同的敏感度。 各国研究者正在进一步建立和完善针对更多的试验材料的胚胎试验，以满足各种生态环境的评估。 随着多学科专业相互渗透的加深，工具日益完善，高通量筛选成为可能，使得应用前景更广泛。,实验材料 终点 方法,谢谢,Catfish (Clarias gariepinus),