代谢调控育种袁丽红

第五节 微生物代谢控制育种技术背景 1956年谷氨酸发酵成功，标志发酵工业进入代谢控制发酵时期 代谢控制发酵时期的核心代谢控制发酵技术代谢控制发酵过程大体上可分为：以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的合成途径和代谢调控机制 选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从而使所需产物有选择性地大量合成和积累代谢控制发酵的关键 微生物代谢调控机制能否被解除 能否打破微生物正常的代谢调节 能否人为控制微生物代谢实现代谢控制发酵的手段 代谢调控育种内因改变主要技术支柱 发酵过程的代谢调控培养外因改变代谢调控育种特点 减少盲目性 定向选育代谢调控育种应用及成果 氨基酸发酵 核苷酸发酵 一些次生代谢产物一、正常微生物代谢调节与控制自我调节 微生物有着一套可塑性极强和极精确的代微生物有着一套可塑性极强和极精确的代谢调节系统，以保证上千种酶能正确无误、谢调节系统，以保证上千种酶能正确无误、有条不紊地进行极其复杂的新陈代谢反应。有条不紊地进行极其复杂的新陈代谢反应。正常的微生物代谢调控方式 调节细胞膜对营养物质的渗透性 通过酶的定位控制酶与底物的接触 控制代谢物流向最主要的调节1.控制营养物质透过细胞膜进入细胞控制营养物质透过细胞膜进入细胞如：只有当速效碳源或氮源耗尽时，微生物才合如：只有当速效碳源或氮源耗尽时，微生物才合成迟效碳源或氮源的运输系统与分解该物质的酶成迟效碳源或氮源的运输系统与分解该物质的酶系统。系统。通过酶的定位控制酶与底物的接触通过酶的定位控制酶与底物的接触 真核微生物酶定位在相应细胞器上；细胞器各真核微生物酶定位在相应细胞器上；细胞器各自行使某种特异的功能；自行使某种特异的功能；原核微生物在细胞内划分区域集中某类酶行使原核微生物在细胞内划分区域集中某类酶行使 功能：功能：与呼吸产能代谢有关的酶位于膜上；与呼吸产能代谢有关的酶位于膜上；蛋白质合成酶和移位酶位于核糖体上；蛋白质合成酶和移位酶位于核糖体上；同核苷酸吸收有关的酶在同核苷酸吸收有关的酶在G-菌的周质区。菌的周质区。通过酶的定位控制酶与底物的接触控制代谢物流向控制代谢物流向(通过酶促反应速度来调节通过酶促反应速度来调节)可逆反应途径由同种酶催化，可由不同辅基或辅酶控制代谢物流可逆反应途径由同种酶催化，可由不同辅基或辅酶控制代谢物流向。向。例如：两种例如：两种Glu脱氢酶：以脱氢酶：以NADP为辅基为辅基 Glu合成合成 以以NAD为辅基为辅基 Glu分解分解 通过调节酶的活性或酶的合成量。通过调节酶的活性或酶的合成量。关键酶（调节酶）关键酶（调节酶）:某一代谢途径中的第一个酶或分支点后的第某一代谢途径中的第一个酶或分支点后的第 一个酶。一个酶。粗调：调节酶的合成（酶合成诱导、酶合成阻遏）粗调：调节酶的合成（酶合成诱导、酶合成阻遏）细调：调节现有酶分子的活性（催化活力）细调：调节现有酶分子的活性（催化活力）通过调节产能代谢速率。通过调节产能代谢速率。酶合成的诱导乳糖操纵子酶合成的阻遏 分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏 产物阻遏色氨酸操纵子产物阻遏色氨酸操纵子lac 操纵子的正调控操纵子的正调控分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏CAP降解物基因活化蛋白降解物基因活化蛋白分解代谢物激活蛋白，分解代谢物激活蛋白，cAMP受体蛋白受体蛋白(CRP)阻遏蛋白阻遏蛋白操纵基因操纵基因结构基因结构基因调节基因调节基因mRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，所以结构基因表达。不能与操纵基因结合，所以结构基因表达。酶代谢产物一旦大量积累酶代谢产物一旦大量积累原核生物基因主要是转录控制。原核生物基因主要是转录控制。调节现有酶的催化活力酶活性的调节调节现有酶的催化活力酶活性的调节 是以酶分子的结构为基础，在酶分子水平是以酶分子的结构为基础，在酶分子水平上的一种代谢调节。是通过改变现成的酶上的一种代谢调节。是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率的方式。分子活性来调节新陈代谢的速率的方式。酶活性的调节的式酶活性的调节的式 酶活性的激活：酶活性的激活：在代谢途径中后面的反应可被较前面的在代谢途径中后面的反应可被较前面的 反应产物所促进的现象；常见于分解代谢途径。如：粗糙脉反应产物所促进的现象；常见于分解代谢途径。如：粗糙脉孢霉的异柠檬酸脱氢酶的活性受柠檬酸促进孢霉的异柠檬酸脱氢酶的活性受柠檬酸促进 酶活性的抑制酶活性的抑制：包括：竞争性抑制和反馈抑制。包括：竞争性抑制和反馈抑制。反馈反馈：指反应链中某些中间代谢产物或终产物对该途径关：指反应链中某些中间代谢产物或终产物对该途径关键酶活性的影响。键酶活性的影响。正反馈：正反馈：凡使反应速度加快的反馈。凡使反应速度加快的反馈。负反馈（反馈抑制）负反馈（反馈抑制）：凡使反应速度减慢的反馈。：凡使反应速度减慢的反馈。反馈抑制反馈抑制主要表现在某代谢途径的末端产物过量主要表现在某代谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性。主要表现在时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。氨基酸、核苷酸合成途径中。特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除Feedback InhibitionFigure 3.Figure 4.1.直线式代谢途径中的反馈抑制直线式代谢途径中的反馈抑制：苏氨酸脱氨酶苏氨酸脱氨酶苏氨酸苏氨酸-酮丁酸酮丁酸异亮氨酸异亮氨酸反馈抑制反馈抑制其它实例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成其它实例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成2.2.分支代谢途径中的反馈抑制：分支代谢途径中的反馈抑制：在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避免在在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物发展出多种调节方式。主要有：应，微生物发展出多种调节方式。主要有：同功酶的调节、顺序反馈、协同反馈、积累反馈调节等。同功酶的调节、顺序反馈、协同反馈、积累反馈调节等。反馈抑制的类型反馈抑制的类型 同功酶调节同功酶调节isoenzyme意义：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。某一产物过量仅抑制相应酶活，某一产物过量仅抑制相应酶活，对其他产物没影响。对其他产物没影响。例：大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节协同反馈抑制协同反馈抑制concerted feedback inhibition定义：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制定义：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。举例：谷氨酸棒杆菌（举例：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、）、多粘芽孢杆菌（多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）天冬氨酸族氨基酸合）天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制和阻成中天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。遏。天冬氨酸天冬氨酸 E,R 4-磷酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸E天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛E,R E二氢吡啶二羧酸二氢吡啶二羧酸 同型丝氨酸同型丝氨酸同型丝氨酸磷酸同型丝氨酸磷酸E,R R O-琥珀酰同型丝氨酸琥珀酰同型丝氨酸 苏氨酸苏氨酸 E,R六氢吡啶二羧酸六氢吡啶二羧酸 胱硫醚胱硫醚 2-酮丁酸酮丁酸 R 二氨基庚二酸二氨基庚二酸同型半胱氨酸同型半胱氨酸 R 赖氨酸赖氨酸 甲硫氨酸甲硫氨酸 异亮氨酸异亮氨酸天冬氨酸族天冬氨酸族（谷氨酸棒（谷氨酸棒杆菌）杆菌）合作反馈抑制合作反馈抑制cooperative feedback inhibition定义：两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二定义：两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二者单独作用之和。者单独作用之和。举例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受举例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和和GMP（和（和IMP）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的70%和和10%。积累反馈抑制积累反馈抑制cumulative feedback inhibition定义：每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途定义：每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时它们的抑制径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时它们的抑制作用是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作作用是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。用。Try 16%CTP 14%氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸 13%AMP 41%积累反馈抑制积累反馈抑制E.coli谷氨酰胺合谷氨酰胺合成酶的调节成酶的调节顺序反馈抑制顺序反馈抑制sequential feedback inhibition一种终产物的积累一种终产物的积累,导致前一中间产物的积累，通过后者反馈导致前一中间产物的积累，通过后者反馈抑制合成途径关键酶的活性，使合成终止。抑制合成途径关键酶的活性，使合成终止。举例：枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的调节举例：枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的调节酶活性调节机制之一：变构调节 变构酶理论变构酶理论：变构酶是一种变构蛋白，变构酶是一种变构蛋白，具有两个或两个以上的立体专一性不同的具有两个或两个以上的立体专一性不同的接受部位，其中之一与底物结合并具有催接受部位，其中之一与底物结合并具有催化活性，称为活性中心；另一部位可与效化活性，称为活性中心；另一部位可与效应物结合的变构部位，称为调节中心。效应物结合的变构部位，称为调节中心。效应物的结合改变酶的立体构象，并导致酶应物的结合改变酶的立体构象，并导致酶活性的变化。活性的变化。酶活性调节机制之二：酶的共价修饰酶的共价修饰 共价修饰共价修饰（covalent modificationcovalent modification）：）：指在专一性酶的指在专一性酶的催化下，某些小分子基团共价地结合到被修饰的酶分子上，催化下，某些小分子基团共价地结合到被修饰的酶分子上，使被修饰酶的活性发生改变，从而调节酶活性。使被修饰酶的活性发生改变，从而调节酶活性。J 共价修饰调节酶：共价修饰调节酶：即通过共价修饰调节活性的酶叫共价修即通过共价修饰调节活性的酶叫共价修饰调节饰调节 酶。酶。J 共价修饰的类型：共价修饰的类型：磷酸化磷酸化/去磷酸化去磷酸化（主要存在于高等动、植物细胞中）（主要存在于高等动、植物细胞中）腺苷酰化腺苷酰化/去腺苷酰化；去腺苷酰化；（主要存在细菌中）（主要存在细菌中）乙酰化乙酰化/去乙酰化；尿苷酰化去乙酰化；尿苷酰化/去尿苷酰化；去尿苷酰化；甲基化甲基化/去甲基化；去甲基化；S-S/SHS-S/SH 酶活性调节机制之二：酶的聚合与解聚二、代谢调控育种技术在发酵工业中的应用 代谢调控育种技术：就是通过定向选育某种特定的突变型达到大量积累目的产物的目的。应用：初级代谢产物生产菌：几乎全部氨基酸、多种核苷酸 次级代谢产物生产菌：抗生素 酶生产菌：通过特定突变型的选育，达到：改变代谢通路 降低支路代谢终产物的产生 切断支路代谢途径 提高细胞膜的透性最终使代谢流向目的产物积累方向代谢调控育种措施调节方式调节方式育种措施育种措施诱导分解阻遏分解抑制1、组成型突变株的选育2、抗分解调节突变株的选育解除碳源分解调节突变株的选育解除氮源分解调节突变株的选育解除磷酸盐调节突变株的选育反馈阻遏反馈抑制3、营养缺陷型突变株的选育4、渗漏型缺陷型突变株的选育5、回复突变株的选育6、耐自身代谢产物的突变株的选育7、抗终产物结构类似物的突变株的选育8、耐前体突变株的选育9、条件突变株的选育细胞膜渗透性10、营养缺陷型突变株的选育生物素缺陷型油酸缺陷型甘油缺陷型11、温度敏感突变株 直线式代谢途径：选育营养缺陷性突变直线式代谢途径：选育营养缺陷性突变株只能积累中间代谢产物株只能积累中间代谢产物 A a B b C c D d E 末端产物末端产物E对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给E，使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），这样才能有利于菌株积累中间产物这样才能有利于菌株积累中间产物C。应用营养缺陷型菌株解除反馈调节应用营养缺陷型菌株解除反馈调节分支代谢途径：情况较复杂，可利用营分支代谢途径：情况较复杂，可利用营养缺陷性克服协同或累加反馈抑制积累养缺陷性克服协同或累加反馈抑制积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵生产末端产物，亦可利用双重缺陷发酵生产中间产物中间产物分支途径分支途径赖氨酸发酵赖氨酸发酵:谷氨酸棒杆菌的谷氨酸棒杆菌的Hom分支途径分支途径肌苷酸发酵肌苷酸发酵（IMPIMP合成途径的代谢调控）合成途径的代谢调控）调控理论的实践应用调控理论的实践应用 应用抗反馈调节突变株解除反馈调节应用抗反馈调节突变株解除反馈调节抗反馈调节突变株：抗反馈调节突变株：是指对反馈抑制不敏感或是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。抗反馈控制突变株可以从抗反馈控制突变株可以从终产物结构类似物抗性突变株终产物结构类似物抗性突变株和和营养缺陷性回复突变株营养缺陷性回复突变株中获得。中获得。目标产物目标产物结构类似物结构类似物赖氨酸赖氨酸S-S-（2 2氨基乙基）氨基乙基）-L-L半胱半胱氨酸氨酸-(AEC)-(AEC)苏氨酸苏氨酸-氨基氨基-羟基戊酸羟基戊酸（AHV)AHV)异亮氨酸异亮氨酸乙硫氨酸乙硫氨酸精氨酸精氨酸D-D-精氨酸精氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸对氟苯丙氨酸（三）控制细胞膜渗透性（三）控制细胞膜渗透性 使胞内的代谢产物迅速渗漏出去使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制。解除末端产物的反馈抑制。1.用生理学手段用生理学手段 直接抑制膜的合成或使膜受缺损直接抑制膜的合成或使膜受缺损 如如:在在Glu发酵中把生物素浓度控制在发酵中把生物素浓度控制在亚适量亚适量可大量分泌可大量分泌Glu；控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性；控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性；当培养液中生物素含量较高时采用当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素适量添加青霉素的方法；的方法；再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是Mn2+；Mn2+的的作用与生物素相似。作用与生物素相似。2.利用膜缺损突变株利用膜缺损突变株 油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型 如如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。产量。甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。控制细胞膜的渗透性控制细胞膜的渗透性1.通过生理学手段控制细胞膜渗透性通过生理学手段控制细胞膜渗透性2.通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性生物素生物素谷氨酸谷氨酸细胞膜渗透细胞膜渗透性性青霉素青霉素谷氨酸谷氨酸油酸缺陷型油酸缺陷型油酸