原位杂交(GISH)程序

原位杂交（GISH）程序1、标记探针：反应体系20卩1打开15C恒温循环水浴。1000ng DNA （根据浓度确定体积）（2卩1 ） +4卩1 Dig-Nick-Translation Mix（每管固定值 4卩1） + ddH2O （14卩1）,混匀、离心，15C水浴 90min （此时打开65C水浴）。15C水浴后+ 0.5MEDTA （pH8.0） 1卩1，混匀、离心，65C水浴中 10min,放入-20 C冰箱。2、压片：（根尖或花粉母细胞）找到中期，有分裂相材料的压片。液氮冷冻10min （不能直接接触液氮），揭片。晾干。3、烘片：晾干后的压片在原位PCR仪（PTC-200，MJ Research, Inc.）上37C烘1hr以上。准备膜。注：烘片前要将原位杂交仪上盖润湿（2xSSC）04、制片预处理：烘干后每片+RNaseA （100yg/m1） 100此，盖膜，PCR37C温育1hr以上。5、配制杂交液：（反应体系40卩L）（冰上操作）打开95C水浴。将DS/甲、10%SDS、放入95C水浴中融化。试剂存放方式用量2片4片6片8片DS/甲-20C20 gL408012016020XSSC4C4gL816243210%SDS-20C1 gL2468SSDNA-20C1 gL2468探针 DNA-20C2.5gL(150ng)5101520封组 DNA-20C2gL/04/08/012/016/0ddH2O4C9.5gL/12gL19/2438/4857/7276/96探针DNA：封组DNA=1： 501： 200。染色体同源性较远的不用封组NDA,相应的体积要加在 ddH2O 上。杂交液混匀、离心，于95C下变性10min,立即置冰上5min以上，备用。6、洗脱：准备膜。打开37C、70C水浴（在通风橱中）。在通风橱配70%甲酰胺：35ml甲酰胺+15ml 2xSSC，放入70C水浴中。 温育后的压片经过以下洗脱：顺序处理温度试剂处理时间（min）137C2xSSC32室温2xSSC3370C70%甲酰胺1.54-20 C70%酒精35-20C90%酒精36-20 C100%酒精3取出，晾干。7、杂交反应：晾干后每片+40此 杂交液，盖膜，进行PCR反应：75C5min, 60C2 min, 55C2 min, 50C30 s, 45Clmin, 42C2 min, 40C5min, 38C5 min； 37C16h 以上。8、洗脱、温育：打开37C水浴。配20%甲酰胺：10ml甲酰胺+40ml 0.5XSSC。杂交后的压片经过以下洗脱：顺序处理温度试剂处理时间（min）137C2xSSC3237C20%甲酰胺几秒钟337C0.5xSSC1.52437C0.5xSSC1.52537C2xSSC36室温4xSSC3取出,稍晾干（不要太干）。准备膜。配 5%BSA： 2 片（0.015gBSA+285yL ddH2O）； 4 片（0.03gBSA+570yL ddH2O）； 6 片（0.045gBSA+855gL ddO）； 8 片（0.06gBSA+1140yL ddH2O）。剩余的 5%BSA 放在 4C 冰箱,待会儿配抗体时要用。方案一：稍晾干后每片+80gL5%BSA,盖膜，PCR37C温育810min。准备膜。准备抗体（50此/片）（冰上操作）：5%BSA:抗体=100： 1 （用与标记探针相 应的抗体）。丁方案二：配5%BSA之后直接准备抗体（配抗体方法同上，配好的抗体可直接放在4C冰 箱中，注意保持黑暗），经洗脱后，稍晾干后每片+80yL5%BSA，盖膜，PCR37C温育8 10min。9、加抗体温育后的压片直接揭膜，每片+50吐抗体，盖膜，PCR37C反应1h。打开37C水浴，并放入1缸4XSSC；室温准备1缸4XSSC。准备抗褪色剂（不能见光、冰上操作）（30、40、50gL/片都行）：抗褪色剂：PI=100： 1 （PI 为红色，无色不能用）。准备盖玻片。10、洗脱、加抗褪色剂（不能见光）反应后的压片取出，揭膜，37C4XSSC洗脱3min、室温4XSSC洗脱3min。稍晾一下 （不能太干），每片+30/40/50此抗褪色剂，盖片。盖上罩子，40min左右，观察。（不能见光）注：等待过种中避免由于盖玻片的滑动，使抗褪色剂外流，造成染色不均。长穗偃麦草与小麦杂交后代原位杂交结果。带有黄绿色信号的染色体是长穗偃麦草染色体，橙红色的是小麦染色体。