脑脊液细胞学检查规范

脑脊液细胞学检查和诊断规范脑脊液细胞学是针对脑脊液细胞的形态学研究，它是在腰椎 （或其他部位）穿刺获取标本后，用显微镜观察脑脊液中细胞形态的一种检查方法。如果我们将脑脊液视为一种组织，那么脑脊液细胞学检查既是对蛛网膜下腔的组织活检，又反映了蛛网膜下腔的病变情况，且许多中枢神经系统疾病的病理生理改变，往往只反映在脑脊液中。因此，脑脊液细胞学检查就显得尤为重要，在脑脊液的诸多检查项目中，其重要性不可替代。它不仅能够为多种神经系统疾病的病因诊断提供帮助，而且在鉴别诊断、病情监测、疗效评价及预后判断方面也具有很高的临床价值。近年来越来越多的扩展到中枢神经系统肿瘤、白血病、寄生虫、脑血管病以及神经细胞免疫功能的诊断、治疗、预后判断及监测等，成为临床工作不可缺少的有力帮手；结合流式细胞术及免疫组化技术，使一些棘手的神经科疾病得到了确诊。但是我国目前脑脊液细胞学诊断发展仍不平衡，实验室操作和报告不够规范。临床和实验技术人员经过系统培训上岗还不够普及。为了更加规范脑脊液细胞学检查和诊断，制定一个简单而便于操作的脑脊液检测和临床应用规范是非常必要的。一、 脑脊液细胞学检查的发展历史脑脊液细胞学检查已有百年历史，20世纪50年代之前只能进行简单的细胞计数和分类。在Sayk和Watson等相继发明了“玻片细胞沉淀法”和“细胞玻片离心沉淀法”后，该方法才有了飞速的发展，成为了一门新型学科脑脊液细胞学。我国的脑脊液细胞学研究开始于20世纪60年代，侯熙德教授和粟秀初教授先后建立了脑脊液细胞学检查室，并研制成功了侯氏自然沉淀器和粟氏FMU-5微型脑脊液细胞玻片离心沉淀仪，在此基础上，对脑脊液细胞的分类、染色和肿瘤细胞检查等进行了大量研究，并制定了脑脊液细胞学检查的一系列规范，举办了多起学习班，出版了多部专著。这些工作为我国脑脊液细胞学的建立与发展奠定了坚实的基础。1986年孔繁元教授引进Cytospin-2玻片离心沉淀仪并国产化，近期第四军医大学西京医院又对原粟氏沉淀仪进行了改进，新一代FMU-6细胞涂片离心沉淀仪已经问世并投入使用。1985年，在粟秀初教授的召集与主持下，由第四军医大学主办召开了我国第一届脑脊液细胞学学术经验交流大会，会上成立了全国脑脊液细胞学联络协作小组。1991年，经中华医学会批准，在原全国脑脊液细胞学联络协作小组的基础上成立了中华医学会神经病学分会脑脊液细胞学学组，2006年学组又更名为感染性疾病与脑脊液细胞学学组。学组的成立与更名对我国脑脊液细胞学研究的发展起到了引领和推动作用。二、 脑脊液细胞学检查步骤 (一)、脑脊液标本的收集和处理l、腰椎穿刺术，收集脊髓蛛网膜下腔脑脊液标本；2、留取脑脊液标本：可按需要缓慢放出脑脊液，依次分别置于34个消毒过的无菌小瓶（试管）中送检，每管1-2ml，若需特殊检查脑脊液可留取3-5ml。各种检验所需的脑脊液量见表；表 各种检验所需的脑脊液量检查项目所需脑积液量（ml）细胞计数总蛋白糖、氯化物蛋白电泳结核涂片和培养、其它细菌涂片和培养肿瘤细胞检验脑脊液细胞学系列：MGG染色墨汁染色阿里新兰染色免疫组化染色0.51.53.03.0-5.03.0-5.03.0-5.02.03.0-5.020.0.51.02.03、留取的脑脊液标本第一管用于细菌培养，第二管用于生化或免疫学检查，第三管用于脑脊液细胞学系列检查，第四管可用于脱落细胞学检查等；4、注意事项：（1）留取脑脊液标本后应尽快送至脑脊液细胞室进行细胞的收集和固定，否则细胞将会变形、变性和自溶，影响结果的观察与判断，一般不超过2小时；（2）注意标本送检时宜平稳运送，不宜摇晃，常温为宜，避免高温、冷冻等；（3）若脑脊液初压过高则不宜放液，仅取其测压管内的脑脊液送检即可； (二)、脑脊液细胞的收集：是脑脊液细胞学检查的前提和重要环节，只有收集到大量形态完整的细胞才能进行染色和分类诊断。目前，脑脊液细胞收集技术以细胞玻片离心沉淀法应用较广，其效果较理想。1、国内目前常用的细胞玻片离心沉淀器：（1）FMU-5型脑脊液细胞玻片沉淀器：由第四军医大学研制，设备简单、价格低廉、操作方便、细胞收集效果满意，适用于基层医疗单位。（2）Cytospin-2或4型细胞玻片离心沉淀仪：由英国Shandon公司制造。细胞收集损失少、结构清晰，标本范围小，便于观察；离心时间、速度和加速度可自控；运转稳定不受电压变化影响；标本置于密闭槽内不污染环境。缺点是价格较昂贵，且不便于携带；（3）FCS型离心沉淀仪：由宁夏医科大学研制，为两用式（即可收集细胞核离心体液），细胞收集率高，分布均匀、清晰，全部材料国产化，价格便宜，适用于基层医疗单位。2、无论使用哪一种细胞收集器，必须符合以下要求：（1）能够收集标本中较多的细胞，损失少；（2）所需脑脊液标本量不宜太多；（3）收集过程既要快速又不损害细胞的形态和结构，细胞分布均匀，清晰；（4）标本范围小，便于观察；（5）能够耐受各种固定剂和染色剂；（6）要求设备简单，便于操作，离心时间，速度和加速度可自控，且运转稳定不受电压变化影响；（7）严格按照各型离心仪操作程序，特别注意离心仪不宜起动过猛或初速过快。由于这种突然的外力作用，常易导致脑脊液细胞的相互撞击或(和)撞向沉淀管的管壁，而造成不同程度的细胞破坏和变形。(三)、脑脊液细胞的染色：是脑脊液细胞学检查中很重要的一步，良好的染色标本不但可为细胞观察分类提供良好的基础，同样对其他特殊意义的细胞的识别也是很重要的。要想获得满意的检查效果，必须标本新鲜和良好的细胞染色。理想的染色剂应使细胞内部结构显示清楚，达到透明，即细胞结构不受其厚度或重叠的影响；分色，即不同细胞结构的染色反应都应反映出来。1、脑脊液细胞学检查常用的染色方法简介：（1）迈-格-姬染色法（May-Gruwald-Giemsa, MGG）：为脑脊液细胞学检查中最适宜的常规染色法，操作简单快速、染色效果好、标本可长时间保存，特别是经改良的MGG一步染色法，具有简单、省时，并能有效的显示胞浆、胞核的微细结构及细胞内外某些化学物质等特点。（2）墨汁染色：用于检测脑脊液中的隐球菌。传统的墨汁染色法为经典的检测隐球菌的方法，快速、简单易行，对隐球菌的形态特征显示好，可以显示肉体和荚膜。但此方法阳性率不高，首次检出阳性率只有54%-74%。为了提高检出率，我们对传统的方法进行了改进，提出了离心墨汁染色法，即用脑脊液玻片离心机制备脑脊液细胞涂片，在涂片未干燥前，立即滴一滴墨汁并进行镜检。该法即提高了阳性率，又避免了其他细胞的干扰，提高了诊断的准确性。（3）阿利新兰染色法：用于检测隐球菌。该法对于隐球菌是特染，染色对比清晰，当隐球菌少时也容易观察到。隐球菌被染成双环蓝色或浅蓝色，其荚膜和菌体间隙为无色，而其他细胞不着色。（4）吖啶橙荧光染色法（Acridine Orange, OA）：适用于对癌瘤细胞的辨认及其胞浆活力状态的判断。由于肿瘤细胞内DNA和RNA对吖啶橙的吸收方式不同，各有不同的荧光反应，细胞核内染色体含有大量的DNA发出亮绿色荧光，胞质和核仁中含有较多的RNA而发出橘黄或橘红色荧光。（5）铁染色法：用于证实颅内有无出血，特别是在脑脊液黄变之后，检查脑脊液中有无含铁血黄素吞噬细胞。亦称为普鲁士蓝染色法。（6）脂肪染色法：用苏丹类染料使细胞内脂滴着色呈棕黑色或深黑色。苏丹黑染色阳性仅见于粒细胞和单核细胞系统以及脂类吞噬细胞，并随前两类细胞的逐渐成熟而增多增粗，至成熟粒细胞最为丰富。（7）PAS染色法：又称高碘酸-Schiff反应，其阳性反应为胞浆中均质性、大小不等的红色颗粒，极为清楚，临床上常用于鉴别腺癌细胞和淋巴母细胞。（8）过氧化酶染色法：可将各期嗜中性粒细胞内的过氧化酶阳性物质染成黄褐色，而单核细胞呈弱阳性反应，淋巴细胞呈阴性反应，并随细胞的逐渐成熟而增多，常用来鉴别形态相似的幼稚细胞。（9）非特异性酯酶染色法：用于测定脑脊液T淋巴细胞数量，并有助于对不同类型白血病的鉴别。（10）硝基四氮唑蓝染色法：用于中枢神经系统感染病原菌的鉴别诊断和疾病病程及抗生素疗效的指标。细菌和真菌感染时为阳性，而病毒结核感染时为阴性。（11）抗酸染色法：主要针对抗酸杆菌。传统的脑脊液抗酸染色和结核杆菌培养无疑是诊断结核性脑膜炎的金标准。尽管传统的抗酸染色法具有简便、快速、价廉之优点，但阳性检出率低；细菌培养阳性检出率略高，但因培养耗时长（4-8周）而失去早期诊断价值。近年来，第四军医大学西京医院神经内科率先开展了改良抗酸杆菌Ziehl-Neelsen玻片染色方法，首次在脑脊液单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞内检测到结核杆菌。该方法被证实操作简便、快速、准确，且大大提高了脑脊液结核杆菌阳性检出率，其灵敏度高达82.90%，远高于传统方法的3.30%，特异度达85%，既可为结核性脑膜炎的早期诊断提供病原学依据，亦对疗效评价具有极高的临床价值。2、脑脊液细胞标本染色的注意事项：（1）送验标本必须非常新鲜，1030分钟内送检并防止污染；（2）必须熟悉各种染色的原理和熟练掌握染色操作步骤并规范操作；（3）脑脊液细胞玻片与组织切片不同，收集细胞有限。因此在各步骤间的冲洗过程一定要小心，避免强烈的晃动与直接快速冲洗，否则大量收集到的细胞则可能被冲洗掉而前功尽弃；（4）了解各种染色的临床意义，对特殊染色技术则应掌握其原理和应用范围，方能为脑脊液细胞诊断提供一份极适应的观察标本；（5）如能收集数张玻片同时进行不同染色，则效果更佳。 (四)、脑脊液细胞的分类：根据我国脑脊液细胞学的多年实践，规范脑脊液细胞分类如下：1、免疫活性细胞：（1）小淋巴细胞；（2）大淋巴细胞；（3）激活淋巴细胞：转化型淋巴细胞、大淋巴样细胞、脑样细胞；（3）浆细胞2、单核吞噬细胞：（1）单核细胞；（2）激活单核细胞；（3）吞噬细胞3、巨细胞4、粒细胞：（1）嗜中性粒细胞；（2）嗜酸性粒xb；（3）嗜碱性粒细胞5、脑脊液室壁细胞：（1）脉络丛细胞；（2）室管膜细胞；（3）蛛网膜细胞6、肿瘤细胞：（1）中枢神经系统原发性肿瘤细胞；（2）转移性肿瘤细胞；（3）白血病细胞；（4）淋巴瘤细胞7、污染细胞：（1）骨髓细胞；（2）红细胞8其他细胞：（1）退化细胞；（2）皮肤细胞；（3）裸核细胞；（4）神经元细胞和神经胶质细胞（五）脑脊液各类细胞的辨认：明确辨别脑脊液各类正常细胞和异常细胞是脑脊液细胞学工作者的基本功。1、各类脑脊液细胞的形态特征：2、脑脊液细胞辨认的注意事项：由于病原体的不同，在脑脊液中可查出各种各样的细胞，有的甚至不能确定和分类。在辨认时须注意以下几点：（1）区别成熟细胞和幼稚细胞：总的来说，细胞越幼稚，其体积愈太，成熟过程中逐渐变小；细胞越幼稚，细胞核愈大，核染色质愈细致疏松，核仁越不明显。逐渐成熟时，核仁从圆形细胞变为椭园、凹陷（淋巴细胞系）、分叶(粒细胞系)、折叠状(单核细胞系)，核染色质逐渐从细变粗和紧密，核仁从明显至模糊、消失。越幼稚的细胞胞浆愈少，着色愈淡蓝。随着细胞成熟，着色愈浅，甚至变为粉红色，颗粒从无到有，并逐渐增多；（2）区别细胞的激活与非激活状态：一些细胞一旦被激活，其形态发生改变，胞浆常见伪足，形成一种葵花样结构。胞核也变为不规则。但这类激活状态的细胞基本形态仍具备有该类细胞的特点。非激活细胞的大小，形态，外观极为一致，而激活细胞则不然；（3）区别良性细胞和恶性细胞：没有一个单纯的特征可以作为辨认良性或恶性细胞的形态学依据，需结合临床考虑。但核的变化是重要的鉴别依据，因为细胞核是传递遗传特征，保证细胞繁殖的中心，因而恶性细胞胞核的改变常常是极为突出的。对恶性细胞的胞核形态特征的了解，有利于在各种良性细胞中准确辨认出恶性细胞；（4）区别细胞与细胞溶解：脑脊液细胞离体后自然溶解速度常常加快，特别在室温条件下，耽误的时间越长则自溶现象越严重。其中嗜中性和嗜酸性粒细胞最敏感，首先发生细胞溶解；单核吞噬细胞欠敏感，但胞浆内吞噬物质越多变性越快，此与细胞本身的功能有关；淋巴细胞则保存时间较长，浆细胞变形也较快。肿瘤细胞早期即有变性。三、脑脊液细胞学诊断程序（一）临床资料的采集：为进一步提高脑脊液细胞学诊断水平，熟悉临床资料十分必要，需设计专用的脑脊液细胞举检查申请单(表71)（二）脑脊液外观及常规细胞计数：先仔细观察送检脑脊液的外观是否清亮，透明和无色或呈何种特殊颜色；有无漂浮物、沉淀物或薄膜形成等。常规细胞计数正常脑脊液细胞中的白细胞计数为0-5个/mm3(0-5106L)；细胞成分仅见淋巴细胞和单核细胞，其比例为7：3或6：4。如细胞数超过5个mm3或正常细胞比倒改变和出现异常形态学变化视为异常脑脊液细胞学。(三)脑脊液细胞标本的观察：以低倍镜浏览全片，对细胞的改变作大概了解,然后再改用油镜进行水平或垂直扫描性观片。应边扫视标本边用细胞分类记数器进行细胞的分类计数，且应至少计数100-200个或200个以上的细胞，计数完毕后再计算出各类白细胞的绝对值和百分比。同时仔细观察各类细胞的形态特征、有无红细胞、寄生虫、细菌或其它组织细胞。(四)脑脊液细胞检查结果分型：以确定属于何种细胞反应为主的脑脊液细胞学类型。如正常细胞型、淋巴细胞型、激活淋巴细胞型、单核或激活单核细胞型、嗜中性粒细胞型、嗜碱性粒细胞型、嗜酸性粒细胞性型、浆细胞型、混合细胞型和肿瘤细胞型等。(五)脑脊液细胞学诊断内容：1、正常还是异常脑脊液细胞学反应；2、异常脑脊液细胞反应的类型；3、有无特殊病理细胞(如肿瘤细胞)或致病菌；4、与临床诊断是否相符或提示其他诊断的可能性。（六)脑脊液细胞学检查报告的书写及格式：书写报告是脑脊液细胞学检查中最后也是最重要的一步，直接体现了脑脊液细胞学检查者的临床思维能力和诊断思路。报告的准确性对临床诊断有重要的提示作用。1、检查报告的内容：(表7-2)2、书写格式：对检查结果的描述应详细客观，结论的描述应准确和简洁，密切结合病史和临床表现，尽最大可能为临床诊断提供帮助。结论中有一下几种格式：（1)脑脊液细胞学检查结果可直接提供病因诊断意见，如在脑脊液细胞学中检测到相应致病菌可诊断为细菌性脑膜炎；在激活淋巴细胞胞浆中发现包涵体可诊断为病毒性脑膜炎；发现隐球菌可诊断为新型隐球菌脑膜炎；在脑脊液白细胞内外发现弓型体滋养体可诊断为弓形体脑炎；在脑脊液中找到血管园线虫幼虫可诊断为血管园线虫脑膜炎；在脑脊液中发现大量红细胞(特别是陈旧红细胞)和红细胞含铁血黄素胆红素吞噬细胞可诊断为蛛网膜下腔出血等；（2）脑脊液细胞学检查结果可提供最可能诊断意见，如在脑脊液细胞学检查发现有形态学特征的异形细胞，最大可能为肿瘤细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞可拟诊为肿瘤、白血病、淋巴瘤；如在疾病早期发现典型的嗜中性粒细胞反应拟诊为化脓性脑膜炎；长期不变的混合胞反应拟诊为结核性脑膜炎；典型的淋巴细胞反应拟诊为病毒性脑膜炎；嗜酸性粒细胞反应为主可拟诊断脑寄生虫病等。但以上还要密切结合临床表现和其它辅助检查；（3）如不能直接提示病因诊断和最可能诊断意见，而又有脑脊液细胞学异常且为非特异性改变可拟诊为异常脑脊液细胞学(淋巴细胞反应)；（4）正常脑脊液细胞学四、脑脊液细胞学检查的临床应用（一）在中枢神经系统感染性疾病诊断中的应用：由各种致病菌引起的中枢神经系统感染性疾病（脑膜脑炎、脑炎、脑膜炎等）为我国当前常见疾病之一，其中由于各种原因导致的临床误诊或漏诊现象十分严重。众多的研究结果表明脑脊液细胞学检查技术对中枢神经系统感染性疾病的诊断具有较好的临床应用价值，检查方法简便、易行，而且也非其他检查方法所能完全替代。1、有助于中枢神经系统感染性疾病的定性诊断：健康人脑脊液中白细胞计数为（0-5） 106/L，主要为淋巴细胞和单核细胞，二者的正常比例为3070-4060。当中枢神经系统遭受不同致病菌侵袭时，其抗原性可引起相应的脑脊液白细胞计数和特征性细胞免疫反应，为其定性诊断提供依据。（1）化脓性脑炎、脑膜炎和脑膜脑炎脑脊液检测 急性期脑脊液白细胞计数常达每升数十亿个，细胞学分类以嗜中性粒细胞反应为主，可达90以上，并伴有浆细胞出现。重症患者或可见脓细胞，在其胞质内外或可检出相应的致病菌等特征性细胞学异常。随着有效的治疗，嗜中性粒细胞比例显著降低或消失，淋巴细胞和单核细胞比例趋于正常。如病情复发，可出现嗜中性粒细胞比例的再次增高。若进入慢性期，细胞学分类多呈现混合性细胞反应。（2）病毒性脑炎、脑膜炎和脑膜脑炎脑脊液检测 脑脊液白细胞计数常在每升数亿个以内，一般以淋巴细胞反应为主，可达90以上，以淋巴细胞和激活淋巴细胞计数增多和比例增高为主，或可在其胞质内检测出包涵体等特征性细胞学异常。病程早期也可出现嗜中性粒细胞，但短时间内即被增殖的激活淋巴细胞和浆细胞替代。部分患者可不出现上述的细胞反应，而是仅以单核细胞和激活单核细胞的增高为主要表现。（3）结核性脑炎、脑膜炎和脑膜脑炎 脑脊液白细胞计数多在(100l000)106L。一般以嗜中性粒细胞、激活淋巴细胞、激活单核细胞和浆细胞并存的混合型细胞反应为主，或可见结核分枝杆菌等致病菌生长，特别是采用改良抗酸染色进行脑脊液细胞学检查，其阳性检出率明显提高，甚至高达100%。以往认为，这种细胞反应类型是结核性脑膜炎的细胞学特征，但研究发现，仅有单核细胞和激活单核细胞比例的增高，也可以是结核性脑膜炎的唯一表现。由于结核感染的特性，细胞学分类的正常化需时较长，甚至可以出现反复。（4）真菌性脑炎、脑膜炎和脑膜脑炎 以新型隐球菌性感染最为常见。因其表现常与结核性脑膜炎相似，临床上难以鉴别。脑脊液中查找到隐球菌是诊断中枢神经系统隐球菌感染的金标准。隐球菌性脑膜炎脑脊液白细胞计数可正常或轻微增高，细胞学分类以激活淋巴细胞和单核-吞噬细胞为主，并可见吞噬隐球菌。经离心沉淀和MGG染色后的隐球菌菌体呈圆形，大小不一，为紫红色，周边可有辐射状毛刺，常呈簇排列，部分菌体可见芽孢。此类隐球菌由于形态特殊，极易辨认，不会遗漏，较只染荚膜的墨汁染色更具优越性，检出率可达100。以中性粒细胞计数增多和比例增高为主，并常可见相应真菌等致病菌生长。（5）寄生虫性脑炎、脑膜炎和脑膜脑炎 脑脊液中发现寄生虫病原体的阳性率很低。白细胞计数常增高，细胞学特点以嗜酸性粒细胞增多为主，最高可达60或更高。在寄生虫入侵的急性期也可伴有不同数量的嗜中性粒细胞，但持续时间较短。以嗜酸性粒细胞计数增多和比例增高为主，脑脊液细胞学检查并可发现相应的寄生虫生长。2、有助于与中枢神经系统非感染性脑膜脑炎和脑炎（病）的鉴别诊断：（1）与急性感染性中毒性脑膜脑炎和脑病的鉴别诊断：此类疾病系指由中枢神经系统以外的全身性感染产生的毒性物质导致的脑膜和脑组织代谢，以及神经递质障碍引起的一种非感染性脑膜脑炎和脑病。由于无致病菌直接侵入中枢神经系统，因此脑脊液细胞学检查以无或少量炎性细胞为主，白细胞计数正常或仅轻度增多，且检测不到致病菌可供鉴别。（2）与脑膜癌病的鉴别诊断：脑膜癌病系指由肺癌、胃癌、乳腺癌结肠癌、前列腺癌、宫颈癌和黑色素瘤等多种肿瘤细胞转移或侵犯脑膜所导致的恶性癌性脑膜病。脑脊液细胞学检查常显示肿瘤细胞胞核增大，核质比失调，着色较深或极深；细胞核增多、变大，形态不一，且核仁增多、变大；细胞分裂活跃，并常出现呈团、呈簇或呈“花瓣”样、腺管状排列等特征性的肿瘤细胞,有助于对此类疾病的鉴别诊断，已成为其他检查无法替代的诊断金标准。（3）与脑膜白血病的鉴别诊断：脑膜白血病系指由白血病瘤细胞对脑膜的弥漫性浸润所致。脑脊液细胞学检查常可见与外周血相同类型的白血病瘤细胞，可资鉴别。已成为中枢性神经系统白血病其他检查方法无法替代的诊断金标准。（4）与出血性脑炎、脑膜炎和脑膜脑炎的鉴别诊断：此类疾病系指因中枢神经系统血管破裂，血液进入脑蛛网膜下腔隙所致的一种非感染性炎症。脑脊液细胞学检查呈现以大量新鲜红细胞和红细胞吞噬细胞为主的细胞反应，且白细胞计数及其分类正常等特点可资鉴别。3、有助于中枢神经系统感染性疾病病情观察和预后评价：（1）脑脊液细胞学的动态检查 如脑脊液炎性细胞逐渐减少或消失、淋巴细胞和单核细胞计数及二者比例显示改善或正常，则提示病情改善或痊愈；反之，显示病情加重或复发。并可为药物治疗决策提供客观依据。（2）先令指数的检查 正常的脑脊液中的中性粒细胞以两叶核和三叶核为主，杆状核和五叶核中性粒细胞极为少见。先令指数检测的是脑脊液中性粒细胞的成熟程度，可分为核左移和核右移，核左、右移的区分线是在杆状核与分叶核中性粒细胞之间进行的。杆状核与分叶核中性粒细胞之正常比值为1/13-1/16（先令指数），比值增大为核左移，比值减小为核右移。先令指数升高（核左移）和白细胞计数增多提示存在急性感染，白细胞活力较强、功能较好和预后较好；反之，先令指数降低（核右移）提示白细胞衰老、功能减退和患者预后不良。（3）中性粒细胞中毒性颗粒的检查 经硝基四氮唑蓝（NBT）染色法，在成熟和幼稚型中性粒细胞胞质中出现大小不等、分布不均匀的粗大深蓝色或蓝黑色颗粒状沉淀物，称为中毒性颗粒。在光学显微镜下计数100 个分叶中性粒细胞中NBT染色阳性细胞百分率。当细菌和真菌感染时其百分率升高（12%），百分率愈高提示炎症愈严重；病毒和结核分枝杆菌感染时一般不升高；病情减轻时NBT染色阳性细胞百分率可出现相应的降低，康复期可以恢复至正常水平。（4）免疫淋巴细胞功能的检测 通过非特异性酯酶（ANAE）染色法将脑脊液成熟淋巴细胞（辅助性T细胞）胞质中的酯酶染成13 个致密而局限的颗粒状棕黄色沉淀物（阳性细胞），并测得健康人的阳性率为（52.00 10.72）%。病情严重和免疫功能低下的患者其阳性率下降，对中枢神经系统感染性疾病患者的细胞免疫功能、病情评价、药物选择及其疗效评价等均具有一定临床实用价值。(二)在中枢神经系统肿瘤诊断中的应用1、中枢神经系统原发性肿瘤：脑脊液中查找到肿瘤细胞是诊断中枢神经系统肿瘤的金标准。但中枢神经系统原发性肿瘤细胞(恶性胶质瘤和髓母细胞瘤除外)的阳性率较低(15-30)，甚至可呈阴性，这可能与肿瘤的位置较深或远离脑脊液通路有关。2、中枢神经系统转移癌：脑脊液肿瘤细胞的阳性率较高，可达75。部分患者常于原发病灶被发现之前就在脑脊液中查到肿瘤细胞，这部分患者常以中枢神经系统损害为首发症状就诊，但CT和MRI却多呈阴性，由此造成了很高的漏、误诊率。此时，脑脊液细胞学检查就成为惟一有效的检查手段。脑脊液中查到肿瘤细胞，可弥补影像学的不足，为诊断提供重要依据。3、中枢神经系统白血病和淋巴瘤：脑脊液中发现白血病或淋巴瘤细胞即可诊断为中枢神经系统浸润，浸润可发生在病程的任何时期。脑脊液发现白血病和淋巴瘤细胞可在中枢神经系统损害症状出现之前。部分以中枢神经系统损害为首发症状就诊的白血病患者，甚至可以出现经脑脊液细胞学检查发现，骨髓确诊，而外周血却找不到幼稚细胞的情况。 (三)在脑血管病方面的应用1、蛛网膜下腔出血和脑出血：当血液破入脑蛛网膜下腔，脑脊液中早期即可见大量红细胞。而以嗜中性粒细胞为主的细胞反应，在短时间内即被激活单核细胞和吞噬细胞所替代。吞噬红细胞、含铁血黄素和胆红质现象可分别于出血后1-3 d内、3-5 d后和7-10 d后相继出现。根据脑脊液中吞噬细胞的有无、胞质内被吞噬物的种类及形态，可估测出血的时间、出血是否停止和有无再出血。2、缺血性脑血管病：除偶见少量红细胞外，细胞学分类多无异常。3、病理性和穿刺误伤性脑脊液的鉴别：如既往未做过腰穿，而在送检的脑脊液中出现吞噬红细胞和含铁血黄素时，应考虑为病理性出血。因为在穿刺误伤的脑脊液中，无论是时间，还是病理过程，都来不及形成像出血患者那样的吞噬细胞。因此。脑脊液中有无吞噬细胞，对病理性和穿刺误伤性脑脊液的鉴别具有重要意义。（四）中枢神经系统免疫功能的评估：中枢神经系统的免疫状态常仅反映于脑脊液中，因而脑脊液免疫细胞成分的分析便成为评价中枢神经系统细胞免疫功能的重要途径。如多发性硬化时脑脊液单个核细胞轻度增高，通常在15106L以内，而视神经脊髓炎约有13的患者可以多于50106L。通过对脑脊液T、B淋巴细胞亚群和活化抗原阳性细胞等的测定，中枢神经系统特殊免疫区域的存在和重要性已经阐明。脑脊液细胞免疫功能的检测，对于神经系统疾病的发病、诊断、免疫抑制剂的应用及预后判定等都具有重要的临床指导意义。五、我国脑脊液细胞学检查的应用现状和存在的问题经过50余年的不断努力，我国脑脊液细胞学检查得到了长足发展，取得了巨大的进步。国内举办了多期推广脑脊液细胞学检查培训班，出版了多部有关脑脊液细胞学的专著；许多医院已经建立了脑脊液细胞学检查室，一些单位还开展了脑脊液细胞学的科研工作。不断地拓展其与边缘学科的密切联系，使得脑脊液细胞学在医疗、教学和科研方面都发挥着重要作用。但是，受各种主、客观因素的影响，此项检查在国内的普及程度仍然十分有限，也未引起同道们(特别是临床检验科室)的足够重视，致使很多单位至今还沿用血球计数板进行简单的白细胞分类(即脑脊液常规检查)的方法，甚至用目测脑脊液的颜色和透明度来替代红细胞和白细胞计数。由于常规检查只能将脑脊液中的细胞分为单个核和多个核细胞，既不能观察到核染色质和胞质酸碱度等细胞结构的重要特征，也不能区分正常单个核与病理性单个核细胞(如白血病与淋巴瘤细胞、肿瘤细胞与吞噬细胞)及多个核细胞(如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)，不仅漏诊误诊在所难免，也极大地限制了临床诊疗水平的提高。“当脑脊液白细胞计数在正常范围时，没有必要进行脑脊液细胞学分类!”持此类观点的并不在少数，尤其是在未开展脑脊液细胞学检查的基层单位。其实并不是所有的神经系统疾病脑脊液白细胞计数都会升高。病毒性脑炎、隐球菌性脑膜炎、中枢神经系统白血病和淋巴瘤、中枢神经系统原发性肿瘤和转移癌及脱髓鞘疾病等的脑脊液白细胞计数都可以在正常范围内，但细胞学分类仍然会有改变。这种变化可以是惟一的、重要的并且具有决定性的临床诊断依据。因此，脑脊液细胞学分类是脑脊液常规检查所不能替代的。随着脑脊液细胞学检查技术日臻成熟，其在神经系统疾病的诊疗应用价值也得到了充分体现。但由于只停留在对细胞形态层面上的观察，导致其仍具有局限性。如中枢神经系统感染时，在未查找到致病菌的情况下，脑脊液细胞学分类虽有一定的规律可循，但却不能提供特异性诊断；脑脊液细胞学检查虽然是诊断中枢神经系统肿瘤的金标准，但仅依靠肿瘤细胞的形态特点却无法判定其性质和来源，尤其是对一些脑膜癌病，肿瘤细胞形态的无特征性不能为原发病灶的查找提供帮助；中枢神经系统感染(如病毒性脑炎和结核性脑膜炎)时，细胞学分类仅有单核细胞和激活单核细胞比例增高，由于这种增高为非特异性，导致致病病原体的确定十分困难。对于上述情况，临床确诊仍需要其他检查的帮助，如对可能的致病病原体进行相关的抗原、抗体或基因检测，肿瘤细胞的特异性染色等。这些问题的存在，极大地阻碍了脑脊液细胞学检查向更高水平和更深层次的发展。六、脑脊液细胞学的深入研究和未来发展方向尽管我们经过多年的努力，取得了公认的进步，但不少问题依然困扰着我们。这就要求我们必须开拓知识面，深化专业知识，大力引进和开发新的技术，努力创造更多更好和更有实效的科研成果。本期中张昆南等旧1应用改进的斑点酶联免疫吸附法检测脑脊液中结核分枝杆菌特异性抗原培养滤液蛋白10和6000早期分泌性抗原靶，以评价其在结核性脑膜炎中的诊断价值，便是非常好的尝试。1、形态学和功能学研究相结合：对脑脊液细胞学的研究从单纯形态学转向形态学和功能学检查相结合，将使其对疾病的诊疗价值达到一个新的高度。如用细胞免疫染色法对脑脊液免疫活性细胞和淋巴细胞亚群进行研究；用细胞化学染色法对不同疾病的脑脊液细胞学的研究；用免疫学和分子生物学方法对脑脊液中的病毒成分、抗原、抗体以及某些肿瘤性或免疫性标志物的检测；应用酶联免疫斑技术检测多发硬化患者脑脊液中特异性抗原反应性B细胞，如髓鞘碱性蛋白、髓鞘脂质蛋白反应性B细胞；吕传真教授曾将酶联免疫斑技术应用于结核菌素抗原反应性B细胞的检测，对结核性脑膜炎的检测有重要意义。近年来，国内外开始运用该技术检测脑脊液中T淋巴细胞对刺激抗原的反应情况。目前已经较为广泛地用于结核性脑膜炎的诊断。在对多发性硬化和重症肌无力患者的检测中发现多发性硬化患者髓鞘碱性蛋白、髓鞘脂质蛋白、髓鞘相关糖蛋白以及髓鞘少突胶质细胞糖蛋白反应性B细胞与T细胞的反应增强，也有用此法检测感染性疾病如神经Lyme病的报道。2、脑脊液细胞的超微结构和断层扫描的研究：近年来国内外学者初步开展了脑脊液细胞超微结构的电镜(透射和扫描)观察和激光扫描共聚焦显微镜的应用研究，在肿瘤、白血病和感染性疾病的研究中有较好的发现，使脑脊液细胞学的研究从细胞水平提高到了亚细胞水平。虽然研究受限于脑脊液细胞标本的制片困难等因素，但目前的研究已经显示出了可喜的进展和广阔的前景一。3、脑脊液细胞培养：由于脑脊液细胞量少，要分析其形态学的情况或表面标志物以反映中枢神经形态状况时，往往需要将脑脊液细胞原代培养增殖后加单抗双标记甚至三标记后进行流式细胞仪分析，国外对此已开展较多，特别是在神经免疫病如多发性硬化的研究。4、脑脊液标本库的建立：脑脊液标本库系将平时临床检验中剩余的并经临床确诊的脑脊液标本低温(-70)库存起来，以供随时调用研究之用。1988年第四军医大学建立了国内第一座脑脊液标本库，随后北京、上海、广州、宁夏、陕西和山东等地的脑脊液标本库也相继建立。此举极大地丰富了国内脑脊液研究的标本来源，有利于学术交流和资料累积。下一步脑脊液标本库应进一步分类为脑脊液库、脑脊液细胞库和核酸标本库。5、新技术和新方法的应用：新技术和新方法应用的探索为临床脑脊液细胞学的研究注入了新的活力。如免疫细胞化学方法对脑脊液免疫活性细胞和结核抗原等的深入研究，自动图像分析法对中枢神经系统肿瘤和白血病的诊断以及正常脑脊液细胞功能的探讨，电泳技术对脑脊液淋巴细胞电泳行为的探讨，脑脊液乳酸，一氧化氮，可溶性白细胞介素2受体，p2微球蛋白，S100b蛋白，神经元特异性烯醇化酶，单纯疱疹病毒抗原、抗体和病毒DNA。弓形虫抗体以及淋巴细胞非特异性酯酶活性的检测等。液相芯片技术在脑脊液研究中的应用将为临床提供一种快速、简便、准确、多种病原或生化指标的同步和高通量检测方法。6、未来研究思路：未来脑脊液细胞学研究应从下述3个方面展开：结构研究：阐明细胞、亚细胞、分子乃至量子的结构，预见它们的功能和行为。信息研究：阐明基因表达和细胞信息的形成、传递与演化过程。层次研究：如基因、分子和细胞之间的相互联系、相互作用和相互影响。我们相信，随着新技术和方法的进一步应用，脑脊液细胞学必将有着长足的发展，充分发挥对临床诊断和研究的辅助作用。参考文献1粟秀初，楼玉珍脑脊液细胞玻片离心沉淀仪的改进及其使用价值神经精神疾病杂志，198l，7：256-2572粟秀仞，孔繁元神经系统临床脑脊液细胞学北京：人民军医出版社，200l3何俊瑛，孔繁元，邵力临床脑脊液细胞学诊断石家庄：科学技术出版社，20074 孔繁元，范学文，吴若芬. 脑脊液细胞学规范化检查和诊断程序.脑与神经疾病杂志，2009:17(1):71-75.5 粟秀初，赵钢，杨毅宁等. 玻片离心沉淀法脑脊液细胞学检查在中枢神经系统感染性疾病诊断中的应用价值.中国现代神经疾病杂志.2013:13(2):98-101.6 赵钢. 脑脊液细胞学的应用现状与未来发展.中华神经科杂志.211:44(2):73-76.7Chen P, Shi M, Feng GD, Liu JY, Wang BJ, Shi XD, Ma L, Liu XD, Yang YN, Dai W, Liu TT, He Y, Li JG, Hao XK, Zhao G. Ahighly efficient Ziehl-Neelsen stain: identifying de novointracellular Mycobacterium tuberculosis and improving detectionof extracellular M. tuberculosis in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol, 2012, 50:11661170.8 赵钢，杜芳. 结核性脑膜炎临床诊断思路.中国现代神经疾病杂志.2013:13(1):1-4.