微生物的实验室培养1PPT

2021/8/2512021/8/252微生物包括哪五类：微生物包括哪五类：真菌真菌原生动物原生动物特点：特点：结构都相当简单结构都相当简单,个体多数十分微小个体多数十分微小.通通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿且体内一般不含有叶绿素素.不能进行光合作用不能进行光合作用.原核生物界原核生物界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界2021/8/253一、培养基的概念、种类及营养要素一、培养基的概念、种类及营养要素1概念：人们按照微生物对概念：人们按照微生物对_的不的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。2种类：按照培养基的形态划分。种类：按照培养基的形态划分。(1)液体培养基：配制成的液体培养基：配制成的_状态的基质。状态的基质。营养物质营养物质液体液体(2)固体培养基：配制成的固体培养基：配制成的_状态的基质。在液状态的基质。在液体培养基中加入凝固剂，如琼脂，制成琼脂固体培体培养基中加入凝固剂，如琼脂，制成琼脂固体培养基，是实验室中最常用的培养基之一，微生物在养基，是实验室中最常用的培养基之一，微生物在其上面生长，可形成肉眼可见的其上面生长，可形成肉眼可见的_，主要用于，主要用于微生物的分离、鉴定等。微生物的分离、鉴定等。固体固体菌落菌落2021/8/254按照培养基的物理性质划分按照培养基的物理性质划分液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长2021/8/255半固体培养基：无动力 有动力(弥散固体培养基：菌落固体培养基：菌落2021/8/256按照培养基的化学成分划分按照培养基的化学成分划分2021/8/2572021/8/258选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物2021/8/259鉴定培养基：鉴定所培养生物的类型2021/8/25102、培养基配制原则：（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。细菌pH为：6.5-7.5；放线菌pH为：7.5-8.5；真菌pH为：5.0-6.0。2021/8/25113、培养基的营养构成 不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、碳源碳源、和、和氮源氮源、无机盐无机盐等营养物质，另等营养物质，另外还需要满足微生物生长对外还需要满足微生物生长对pH、特殊特殊营养物质营养物质,例如例如:生长因子生长因子(即细菌生长必即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物需，而自身不能合成的化合物,如维生如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。气、二氧化碳、渗透压等的要求。2021/8/25122021/8/2513特别提示特别提示(1)微生物最常用的碳源是糖类，尤其微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。(2)对异养微生物来说，含对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机物的有机物既是碳源，又是氮源、能源。既是碳源，又是氮源、能源。(3)有些培养基不需要添加生长因子，生物自己能有些培养基不需要添加生长因子，生物自己能合成；而绝大多数微生物培养需要加入生长因子，合成；而绝大多数微生物培养需要加入生长因子，原因是他们缺乏合成这些物质所需要的酶或合成原因是他们缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。能力有限。2021/8/2514pH 特殊营养物质特殊营养物质 氧气氧气 维生素维生素 酸性酸性 中性或微碱性中性或微碱性 无氧无氧 2021/8/2515二、无菌技术二、无菌技术1获得纯净培养物的关键是防止获得纯净培养物的关键是防止_的入的入侵，具体操作如下：侵，具体操作如下：(1)对实验操作的对实验操作的_、操作者的衣着和手进行清、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。洁和消毒。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。等器具进行灭菌。(3)为避免周围环境中为避免周围环境中_的污染，实验操作的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。应在酒精灯火焰附近进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与_相接触。相接触。外来杂菌外来杂菌空间空间微生物微生物周围的物品周围的物品2021/8/2516旁栏思考题旁栏思考题1无无菌技术除了用来防止实验室的培养物被菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？其他外来微生物污染外，还有什么目的？解析解析许多微生物对人类是有害的，因此实许多微生物对人类是有害的，因此实验室中无菌技术还能有效避免操作者自身被微生验室中无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。物感染。答案答案无无菌技术还能有效避免操作者自身被菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。微生物感染。2021/8/25172消毒和灭菌消毒和灭菌(1)消毒消毒概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或体表面或_一部分对人体有危害的微生物一部分对人体有危害的微生物(不不包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子)。常用方法：常用方法：_消毒法、巴氏消毒法、化学药消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法等。剂消毒法等。(2)灭菌灭菌概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外_的的微生物。微生物。常用方法：灼烧灭菌、干热灭菌、常用方法：灼烧灭菌、干热灭菌、_灭灭菌。菌。内部内部煮沸煮沸所有所有高压蒸汽高压蒸汽2021/8/2518(1)消消毒和灭菌的区别毒和灭菌的区别2021/8/2519 （2 2）常用的消毒、灭菌手段）常用的消毒、灭菌手段 2021/8/25202021/8/2521(2)灭菌所依据的原理基本都是使菌体内的蛋白质和核灭菌所依据的原理基本都是使菌体内的蛋白质和核酸发生变性，从而达到杀菌的效果。酸发生变性，从而达到杀菌的效果。(3)消毒时一般不能杀死微生物的芽孢的原因是：芽孢消毒时一般不能杀死微生物的芽孢的原因是：芽孢是细胞生长发育后期，在细胞内形成的一个圆柱或椭圆是细胞生长发育后期，在细胞内形成的一个圆柱或椭圆形形、厚壁、含水量极低、抗逆性很强的休眠体，它抗、厚壁、含水量极低、抗逆性很强的休眠体，它抗热、抗化学药物、抗静水压的能力极强。热、抗化学药物、抗静水压的能力极强。2021/8/2522思维激活思维激活1 用用酒精擦拭实验者手臂属消毒还是灭酒精擦拭实验者手臂属消毒还是灭菌？菌？70%与与95%的酒精，哪一种效果更好？为什的酒精，哪一种效果更好？为什么？么？提示提示酒精擦拭属化学消毒，酒精消毒时，酒精擦拭属化学消毒，酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好。原因是：浓度过高，使菌的酒精杀菌效果最好。原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。2021/8/25231、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存2021/8/2524三、纯化大肠杆菌的无菌操作三、纯化大肠杆菌的无菌操作本实验使用本实验使用_固体培养基进行大肠固体培养基进行大肠杆菌的纯化培养，可分成杆菌的纯化培养，可分成_和纯化大和纯化大肠杆菌两个阶段进行。肠杆菌两个阶段进行。牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨制备培养基制备培养基1制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤：称量称量 倒平板。倒平板。(2)倒平板的过程：倒平板的过程：在火焰旁右手拿锥形瓶，左手在火焰旁右手拿锥形瓶，左手 。右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过 。左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，左手立刻养皿，左手立刻 。待平板冷却凝固后，将平板待平板冷却凝固后，将平板 放置，使皿盖放置，使皿盖在下、皿底在上。在下、皿底在上。计算计算溶化溶化灭菌灭菌拔出棉塞拔出棉塞火焰火焰盖上皿盖盖上皿盖倒过来倒过来2021/8/25251制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计计算：依据牛肉膏蛋白胨培养基配方比例，计算：依据牛肉膏蛋白胨培养基配方比例，计算配制算配制100 mL 的培养基时，各种成分的用量的培养基时，各种成分的用量 称量：牛肉膏比较黏稠，可用称量纸称取，牛称量：牛肉膏比较黏稠，可用称量纸称取，牛肉膏和蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称肉膏和蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖后要及时盖上瓶盖2021/8/2526无菌检查：将灭菌的培养基放入无菌检查：将灭菌的培养基放入37的温室中培养的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。小时，以检查灭菌是否彻底。2021/8/2527倒平板倒平板:2021/8/2528微生物培养中有关实验操作的注意事项微生物培养中有关实验操作的注意事项1倒平板操作倒平板操作(1)培养基灭菌后，需冷却至培养基灭菌后，需冷却至50 左右时才能倒平左右时才能倒平板，原因是琼脂在板，原因是琼脂在44 以下凝固。以下凝固。(2)培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开。打开。(3)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。菌污染。(4)平板冷凝后要倒置的原因：防止皿盖上的冷凝平板冷凝后要倒置的原因：防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。水落入培养基，造成污染。(5)若倒平板时，培养基溅在皿盖和皿底之间的部若倒平板时，培养基溅在皿盖和皿底之间的部位，这个平板应丢弃。位，这个平板应丢弃。2021/8/2529倒平板操作讨论题倒平板操作讨论题1培培养基灭菌后，需要冷却到养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？温度？答案答案可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。进行倒平板了。2为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答案答案通通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。染培养基。2021/8/25303平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答案答案平平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4在倒平板的过程中，如果不小心将培养基在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？培养微生物吗？为什么？答案答案空空气中的微生物可能在皿盖与皿底之气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。养微生物。2021/8/2531（二）、纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.2021/8/2532菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。2021/8/2533菌落细菌的菌落特征因种而异 2021/8/2534霉菌的菌落特征因种而异菌落2021/8/2535接种环接种针2021/8/2536 平板划线的操作方法交叉划线法连续划线法 2021/8/25372021/8/25382021/8/2539 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2021/8/2540 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2021/8/25412021/8/2542涂布器2021/8/25432021/8/2544 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。2021/8/25452021/8/2546四、课题成果评价（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，(在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐)则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，(在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。)则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。2021/8/25472021/8/254831培养未接种培养基的作用是培养未接种培养基的作用是对照对照，若有菌落形成，说明培养，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。基灭菌不彻底。32在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白白色，为圆形，光滑有光色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。泽，边缘整齐。33培养培养12h和和24h后的菌落大小后的菌落大小不同不同（相同、不同）；菌落分（相同、不同）；菌落分布位置布位置相同相同（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。34在某培养基上出现了在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。不彻底或杂菌感染等。n结果分析与评价n课题延伸（P20）2021/8/25491、临时保藏法对象：温度：缺点：2、甘油管藏法：对象：温度：频繁使用的菌种 4（冰箱）容易被污染或产生变异 长期保存的菌种-20（冷冻箱）2021/8/2550本课题知识小结:2021/8/2551【典例解析】例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量 解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。答案：D2021/8/2552例2下面对发酵工程中灭菌的理解的是A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前答案：B 解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是A正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。2021/8/2553例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 .自养型微生物 含碳有机物 2021/8/2554（3）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。（4）表中营养成分共有 类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。（6）右表中各成分重量确定的原则是 。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。固氮微生物 3 调整pH 依微生物的生长需要确定 琼脂（或凝固剂）