微生物药物概述

微生物药物概述张晨梁 制药工程 121235005微生物药物作为广泛使用的临床药物具有重要的地位，尤其是在抗感染、抗肿瘤、降血脂和抗器官移植排异方面具有不可替代的作用。自 1929 年青霉素被发现后，20 世纪 40 年代以来，已有上百种抗生素先后用于临床的细菌感染治疗、肿瘤化疗、降血脂以及器官移植抗排异反应。总体上，由于微生物药物特别是抗生素的广泛应用使人类的寿命延长了 15 年。广义的微生物药物即由微生物发酵获得的药物现约占全球医药生产产值的50%。微生物制药无疑属于生物制药的范畴，如果从微生物的分类及微生物的研究对象与内容看，很难将两者严格划分。传统化学制药的黄金时代已经过去，而生物技术药物已成为当今最活跃、发展也最迅速的领域。它是集生物学、医学、药学的先进技术为一体，以组合化学、药学基因、功能抗原学、生物信息学等高技术为依托，以分子遗传学、分子生物学、生物物理等基础学科的突破为后盾形成的技术和产业领域。随着人类基因组研究的深入和对生命本质的揭示, 越来越多与人类疾病相关连的靶标被确定，生物制药将会有更大的发展空间。1 微生物制药的概念及特点1.1 微生物药物的定义1929 年，英国科学家Alexander Flemin 发现了第一个抗生素青霉素之后便开创了抗生素时代，无论从科学还是经济价值而言，抗生素是目前最重要的微生物生物技术产品。微生物制药技术是工业微生物技术最主要的组成部分。微生物药物的利用是从人们熟知的抗生素开始的，近年来，由于基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，报道的微生物产生的除了抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质日益增多，如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活动的范围。这些物质均为微生物次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序及生产工艺等方面和抗生素都有共同的特点，但是把它们通称为抗生素显然是不恰当的。人们对微生物药物的认识是从抗生素开始的，如今大多学者对微生物药物的理解是：由微生物在其生命活动过程中产生的具有生理活性( 或称药理活性) 的次级代谢产物及其衍生物，当然也有学者定义微生物药物是指应用微生物直接合成或通过微生物转化生产的临床上治疗人类多种疾病的药物。尽管对微生物药物的表述不尽相同，但它们的内涵却是一致的，即微生物药物包含以下两大部分：具有抗微生物感染和抗肿瘤作用的传统意义上的抗生素以及非抗菌的生理活性物质，诸如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、抗氧化剂和细胞因子诱导剂等。1.2 微生物药物的范畴及主要研究内容1.2.1 范畴与种类 随着现代生物医药技术的发展，微生物药物的范畴和种类也在不断地延伸和增长, 目前主要包含以下各类：( 1) 抗生素类药物，其中又可分成10 余类。( 2) 维生素类药物，如维生素B2、B12、B-胡萝卜素、L-肉碱等。维生素是六大生命要素之一，为整个生命活动所必需。一胡萝卜素是强力抗氧化剂，有抑制癌细胞增殖和提高机体免疫力等作用。它还是V A 的前体，食用有益于视力保健，有抗“三C”保健功能之称，即所谓抗癌、抗心血管疾病和抗白内障。V C 和V E 均系抗氧化剂，前者可阻止、破坏自由基形成，还具有激活免疫系统细胞的活力，刺激机体产生干扰素以抵御外来侵染因子。至于v E 可产生抗体，增强机体免疫力；对一胡萝卜素功能具保护作用，使之免遭破坏。常服用V E 有益于抗衰老和防治前列腺癌及痴呆症等。除真菌外，也发现某些细菌，如瑞士乳杆菌、球形红杆菌具发酵生产类胡萝卜素的能力，为其大规模生产成为可能。微生物发酵生产V C 早已取得重要突破，利用所谓“大小菌落” 菌株混合培养生产V C 的运行机制已经成熟，进人产业化。为了进一步提高V C 产率，细胞固定化技术得到应用，如将氧化葡萄糖杆菌与一种蜡状芽抱杆菌混合菌共固定化发酵生产，大大提高V C 的收率，最高达到80 % 以上，比传统V C 生产工艺周期缩短了三分之一，大大提高产率。( 3) 氨基酸类药物：有20 余种药用氨基酸可用发酵法生产。( 4) 核苷酸类药物：如肌苷、腺苷、鸟苷酸、腺苷酸等，由微生物直接发酵制取。( 5) 酶与辅酶类药物： 如心血管疾病治疗酶链激酶、抗肿瘤的L-门冬酰胺酶以及辅酶A 等。( 6) 酶抑制剂： 如HMG-CoA 抑制剂、B-内酰胺酶抑制剂等。这些年来，除链激酶、链道酶或两酶混合称“双链酶” 、尿激酶、葡糖激酶、金葡激酶、组织型纤溶酶激活剂等之外，闯激酶也得到开发，它们都是溶血栓的有效药物，进人临床实用。应该看到，微生物产生的溶血酶有着显著的优点：只要有优质的种子、生产工艺条件成熟以及其产品的有效性或高效性，即可实现规模生产。(7) 免疫调节剂：如用于器官移植手术的环孢菌素A 等。(8) 激素类药物： 如通过微生物转化而得来的醋酸可的松、氢化可的松、醋酸泼尼松等。1.2.2 研究内容二千多年前, 我国劳动人民就利用豆腐来治疗痈症，这是人类历史上利用微生物药物治疗疾病最早的记载。随着细菌学的发展，人们利用微生物间的拮抗现象来治疗疾病逐渐增多，直到1929年从青霉菌的培养液中分离得到对金黄色葡萄球菌有较强杀灭活性的青霉素，由此，抗生素逐步得到了发展。20世纪50年代后， 生物学科发展到一个划时代的新阶段，从药物化学中逐渐分离出了研究微生物抗生物质的抗生学(An tib io tics) ，此阶段是抗生素发现的黄金时代，1944 年发现的红霉素；1947年发现的氯霉素；1948年发现的四环素等等，这些发现促进了微生物发酵工业的发展，人们认识到，微生物代谢产物中不仅有许多可作为治疗的药物，而且还可借助微生物转化来合成用化学方法难以合成的药物或中间体。微生物药物学就是在这样一个历史背景中诞生和成长的。具体来说，微生物药物是随着抗生素、维生素、氨基酸、甾体激素等由微生物代谢所产生的药物和必须利用微生物转化来完成的各类半合成药物的发展而形成的。从20 世纪70 年代到80年代，现代生物技术的发展又跃人一个新纪元，形成了以遗传工程为指导, 微生物工程为基础，包含细胞工程和酶工程的生物工程新领域。近年来，生物技术首先在医药领域显露锋芒，应用生物技术研究开发新药，改造、替代传统制药工业技术，加快医药生物技术产品的产业化是当代医药工业的一个重要发展方向。（1） 微生物学: 包括微生物药物产生菌的筛选、分类、保藏，微生物药物的生物合成，分子生物学在微生物药物中的应用等。（2） 微生物药物化学: 包括微生物药物的分离、纯化、化学鉴别、结构测定与确认等。（3）微生物来源的生理活性物质的药效学、一般药理学、毒理学、药代动力学与临床评价等。（4） 微生物药物的作用机制与耐药机制。（5） 寻找微生物药物的有效途径与方法: 传统筛选模型与路线以及现代技术与手段的应用。（6） 微生物药物制造工艺与质量监控。1.3 微生物制药的研究进展生物制品是指人工免疫中用于预防、治疗和诊断传染病的来自生物体的各种制剂的总称。可分为疫苗类、毒素免疫血清、细胞免疫制剂和免疫调节剂。预防制品主要是疫苗，包括菌苗和疫苗内毒素。治疗制品多数是用细菌病毒和生物素免疫动物制备的抗血清或抗毒素及人特异丙种球蛋白。1.3.1 疫苗自从甲型H1N1 流感疫苗( 简称疫苗) 大规模地在人群中接种后，甲型H1N1 流感( 简称H1N1) 的发病率已大大降低，疫苗表现出良好的流行病学保护作用。随着时间的推移，接种疫苗后人体对H1N1 免疫水平有下降的趋势，易感人群又有被感染的可能。因此有必要开展接种疫苗后感染H1N1 的临床研究。1.3.2 类毒素麻痹性贝类毒素( Paralytic shellfish poison PSP) 中毒已经作为重要的公共卫生问题得到了全世界的关注。人类通常摄入因食用滤食浮游生物( 含有毒微藻类) 后产生PSP 的贝类水产品( 如蚌类，牡蛎和蛤等) 而引起麻痹性贝类中毒，中毒症状以神经系统症状为主甚至引起死亡。在所有的贝类产品食物中毒事件中，麻痹性贝类中毒被公认为是对健康危害最严重的之一。资料报道1972 1982 年日本中毒患者达1192 人，1981 年西班牙有5000 人中毒，1983 年菲律宾300 人中毒，并有21 人死亡，截至目前，全球沿海地区都有麻痹 l 生贝类中毒致死事件的报道。PSP 是一类神经肌肉麻痹剂，对人体的作用机理主要是阻断细胞钠离子通道，造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。贝类摄入此毒素对本身无害，因毒素在贝类体内呈结合状态。当人食入后，毒素会迅速释放并呈现毒性作用，潜伏期仅数分钟或数小时，症状包括四肢肌肉麻痹、头痛恶心、流涎发烧、皮疹等，严重的会导致呼吸停止。PSP 毒性强，其毒性是眼镜蛇毒性的80 倍，其毒力与神经毒气沙林相同，在国际条约中已被列为化学武器。目前还没有针对麻痹性贝类中毒的特效解毒剂，因此人类摄入超过一定限量的PSP 时，其病死率达100%。1.3.3 免疫血清含有特异性抗体的血清叫免疫血清。利用免疫血清对人体进行人工被动免疫，可使机体立即获得免疫力以达到治疗效果或紧急预防的目的。但应抗体非自身产生，耗完后就无补充，所以其免疫时间很短。例如，对伤寒、副伤寒的临床实验室诊断主要包括细菌培养分离、生化鉴定及血清学试验。细菌分离培养可能由于被检者用过抗菌药物，结果有时成阴性，或者由于检查过程复杂难以达到早期诊断的目的，此时，血清学试验往往具有重要的诊断价值。因此肥达反应迄今仍然是临床诊断伤寒的重要实验室指标。人患伤寒、副伤寒后，约经1 2 周，血清内产生相应抗体，此种抗体在体外与相应细菌( 伤寒、副伤寒杆菌) 结合时，能使细菌发生凝集。肥达试验即是依据此原理用已知伤寒沙门菌菌体 ( 0) 抗原和鞭毛( H) 抗原，以及引起副伤寒的甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌和希氏沙门菌H 抗原的诊断菌液与受检血清作试管或微孔板凝集试验，测定受检血清中有无相应抗体及其效价的试验。在我们实验教学中，通常采用免疫后的兔血清来代替人血清进行肥达反应，通过实验现象的观察和实验结果的分析，帮助学生理解肥达实验的原理、操作方法、结果判断及临床意义。1.4 微生物药物的地位及重要性1.4.1 临床地位微生物药物在临床上占据着极其重要的地位，从抗感染治疗中的临床用药来看，直接来源于微生物代谢产物的抗生素及其衍生物用量最大，品种最多。对2005 年我国医药市场的调查得出，抗感染药物的销售仍居第一位。（1）抗细菌：20 世纪后半叶, 抗生素的发现和应用控制了大多数由细菌引起的感染，明显降低了与感染相关的死亡率。此为微生物药物的主要应用领域，种类繁，品种多，用量大。临床上普遍使用的有B内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类等。(2) 抗真菌：此类抗生素的品种和数量较为有限，少有新品投入市场, 90 年代以前，主要有多烯大环内酯，如制霉菌素、两性霉素，克念菌素等，以及非多烯抗真菌抗生素，如灰黄霉素、西卡宁等。近年又相继开发出微生物来源的新型抗真菌抗生素卡帕芬净、米卡芬净和anidulafungin 等。(3) 抗病毒：几十年来, 筛选出不少具有抗病毒活性的抗生素, 但皆因体内疗效与毒性等问题不能实际应用。但由微生物制造的中间体用于合成抗病毒药物不乏成功的例子，尽管如此，新的抗病毒微生物药物的筛选与应用, 是医药微生物工作者面临的艰巨任务。(4) 抗肿瘤：抗肿瘤抗生素在抗癌药物中占有重要地位，有几十种之多，如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、柔红霉素、放线菌素C、D 等。抗肿瘤药物是药学研究的热点领域，正从传统的细胞毒性药物向针对机制的多环节作用的新型抗肿瘤药物发展，从植物、海洋生物以及微生物中寻找新型结构的化合物仍是肿瘤药物研发的一种有效途径。1.4.2 应用领域微生物药物在临床上的应用已从其典型的抗感染和抗肿瘤作用，拓展到免疫调节，降血糖、降血脂等临床治疗。此外，微生物药物又是农业和畜牧业中的重要药物，广泛使用的有除草剂、动植物生长促进剂以及抗菌抗虫剂等。微生物资源丰富，尤其是对一些稀有微生物的深入研究，必将发现新的微生物来源的药物, 应用领域也会随之而扩展。2 微生物药物创制的途径、方法与新技术的应用微生物药物的研究包括微生物新药的研究与微生物药物生产工艺技术的研究等两个方面，前者包括不同生态条件下样品的采集、不同种类微生物的培养与分离、微生物的液体或固体培养、筛选样品的制备、生物活性的分析、活性化合物的分离与纯化、化合物药效测定与结构鉴定、临床前其他研究和临床研究等, 后者包括生产菌株的改良和发酵与提取工艺的优化等。从微生物的分离到发现新的生物活性化合物的筛选流程见图1，从先导化合物开始进入药物开发阶段见图2。图1 图2 经过近80 年的研究与开发，一大批微生物来源的抗生素被应用于临床治疗，客观地说从微生物次级代谢产物中发现新的抗生素已愈发困难，但是通过扩大微生物的来源，构建新筛选模型，伴随着新药开发新技术、新方法及新装备的应用，微生物仍是新药开发者取之不竭的源泉。2.1 组合生物合成技术( Combinatorial biosynthesis technology)组合生物合成是指应用基因重组技术重新组合微生物生物合成微生物药物的基因丛，产生一些新的非天然的基因丛，从而合成许多新的非天然的化合物, 为微生物药物的筛选提供丰富的化合物资源。该技术是建立在微生物药物生物合成途经和相应的基因丛清楚的基础上，目前主要集中于聚酮类合成途经( polyket ide synthesis pathways)的重组与改造，如红霉素、利福霉素和avermectin等化合物的生物合成途经的重组，其原理见图3 所示。在编码红霉素生物合成基因丛中删除某个基因或更换几个基因，导致编码红霉素基因丛的改变，能够合成新的红霉素结构类似物。图3 2.2 基于微排的基因组技术微排(microarray) 或基因芯片是最近发展的基因组技术，与基因组一起被列为1998 年十大突破性技术之一。该技术加速了生物系统的遗传分析，能够使研究者综合和及时考察不同生理状态下的生物细胞，主要应用于细胞分化和进化的研究、临床微生物的研究、抗生素耐药的研究、拯救环境污染的研究和新微生物药物发现的研究。基因芯片基因组技术的原理是根据微生物基因组研究的成果，确定目标基因的DNA 序列，设计和合成针对每个基因的寡核苷酸引物，并连接到芯片的微孔，通过样品杂交、扫描获得相关的信息，应用计算机处理，从而发现重要的数据。目前，该技术已经成功地应用于微生物药物生产工艺的研究，主要发现抗生素生产菌株中调节抗生素生物合成的相关基因，通过基因重组技术改造生产菌株获得高产的基因工程菌株。基因功能的揭示对基于基因组的药物开发是非常关键的，利用功能基因组学药物作用靶点进行研究识别，有助于加速新机制、新来源新药的开发。如DNA微阵列技术，该技术是在固体表面上集成已知序列的基因探针， 被测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与上述探针阵列进行杂交， 通过检测相应位置杂交探针，实现基因信息的高通量快速检测。应用此技术可监测不同环境条件下细菌基因的表达情况，尤其是胁迫环境下特殊功能的耐受基因的研究。2.3 RNA 聚合酶功能修饰技术抗生素生物合成调控机理的研究发现，抗生素生物合成途径中的特异性调节基因和其它调节基因的过量表达，均能够诱导抗生素的过量合成，为抗生素生产菌株的选育提供了重要的遗传信息。RNA 聚合酶的功能与抗生素生物合成基因丛的表达可能存在一定的关系，通过修饰RNA 聚合酶的功能可能调节某些抗生素的生物合成水平。应用RNA 聚合酶功能修饰技术能够活化和加强抗生素的生物合成水平。抗生素(微生物药物)在临床和非临床中的应用具有其他药物无法替代的价值。我国已经能够生产出世界上已有的大部分品种。但是，整个抗生素产业的发展表现为：像青霉素和红霉素等大宗品种规模化集聚，竞争剧烈；像万古霉素和替考拉宁等非专利/ 新品种0虽然盈利空间较大，但技术容易扩散而获利周期较短；像头孢硫脒和依替米星具有自主知识产权的新药尽管市场不大，但获利周期长，因而不少企业具有较大的研发热情。多年来，一些相关的科研院所和企业的研究机构不仅开发了一系列的新品种和新工艺，而且在创新药物的研究方面也取得了一些可喜的成绩，为我国抗生素工业的发展做出了重要的贡献。2.4核糖体工程技术核糖体负责把编码在信息RNA 中的遗传信息翻译为功能蛋白质。原核生物的核糖体由30S 的小亚基与50S 的大亚基形成动态的复合体执行翻译功能，在翻译水平上的调节与核糖体的功能密切相关。研究表明，通过修饰核糖体的功能能够活化或加强微生物合成抗生素的水平，证明核糖体工程技术能够应用于微生物药物的研究。2.5膜分离技术随着基因工程技术的不断发展, 由发酵法生产的微生物药物的分离和纯化正面临着一系列新的问题，如含量低、活性高、易失活、提取收率低等。膜分离过程作为一种新型的分离技术，在现代生物制药分离工程中具有巨大的应用潜力，得到了广泛的发展，已经用于酶、活性蛋白、氨基酸、维生素、甾体、疫苗等物质的分离纯化，而膜分离技术在抗生素提炼中的应用也是重点推广的领域之一。膜分离过程作为一门新型的分离、浓缩、提纯及净化技术，具有节能，不破坏产品结构、少污染和操作简单、可在常温下连续操作、可直接放大、可专一配膜等特点，且各种膜过程具有不同分离机制，适于不同对象和要求。由于其特别适合用于热敏性物质的分离，在食品加工、医药等领域有其独特的实用性。用于微生物药物分离和纯化中的膜分离技术主要涉及微滤、超滤、纳滤、液膜分离和反渗透等。微生物制药尽管在医药工业领域中所占份额有限，但其作用与地位却是不可动摇的。在生物制药领域具有自主知识产权的技术被发达国家垄断的今天，创制具有我国自主知识产权的新化学结构的I类新药是创新型国家的必由之路。伴随着新技术革命的来临，许多新技术和新方法被应用于微生物药物的研究，除本文介绍的几种方法以外，其他方法如重组抗体技术、人类基因组和蛋白组技术、高通量筛选技术和酶的改造技术等均能够更新微生物新药的筛选与发现研究。我们相信，在不久的将来微生物药物的研究一定能够取得更大的成就，为人类的健康作出更大的贡献。参考文献：1、司书毅，姜威，白硕可，微生物药物研究进展与发展趋势，中国医药生物技术，2011 年4 月第6 卷第2 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