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青岛大学硕士学位论文应用SLI-TOF-M技术筛选早期胃癌血清生物标志物研究姓名：李春伟申请学位级别:硕士专业:普通外科指导教师：张佃良41 / 41应用SEIOS技术筛选早期胃癌血清分子标志物研究摘要目的:应用表面加强解吸电离一飞行时间质谱(uraerthncod lase orpininiztionie.-lihtmass spcromey，SLTOF.MS)技术对胃癌患者血清蛋白指纹图谱进行分析,筛选候选肿瘤标志物以建立诊断模型，寻找更可靠的评价标准用于早期胃癌诊断和临床分型以指导个体化治疗，旨在进一步提高对 肿瘤分期和预后的判断,以更好地监测治疗效果.方法:表面加强解吸电离一飞行时间质谱技术及其配套蛋白质芯片检测16例胃癌患者和83例健康人的血清蛋白质组图谱，运用BiomarkerWizard T和 Biomake PatterT软件分析处理数据筛选具有明确临床价值的分子标记物或其组合,以进行早期分子诊断并建立胃癌诊断分类树模型。 结果：胃癌组血清与正常人血清蛋白质谱共有34蛋白表达存在统计学差异 （pO。0),其中73m/,16 mz，4526 /,6 m,1 m/z和7778 m/z 蛋白质峰组成诊断模型I,可将胃癌与正常人正确分组,灵敏度、特异性分别为 93。%、915；另外，287 m/,6121 z和777 mz蛋白质峰组成诊断模型II，可将早期胃癌与iiiiiv期胃癌，其敏感性和特异性分别为93（42/7）、 92。62（11312）。结论：利用SED-0F-MS技术在人血清中可以筛选到早期胃癌快速诊断的特异 性标志物，建立早期胃癌诊断的蛋白质模型；该方法在胃癌诊断尤其早期胃癌诊断 方面具有重要的价值,值得进一步研究。硕士研究生：李春伟普通外科 指导教师：张佃良教授主任医师关键词：胃癌分子标志物表面加强解吸电离一飞行时间质谱蛋白质组模式/y2 “0 m4”3哺删9眦4、呱8Aaysisofserum bmrker screng origosis of saeI gastrccer sing SLDI-TFMSbtajetie:T make arteocanals sin suraceehancd aser desorption/inizaton tieofflgt pctomtry（SELDIOFMS)on th srum of stageI gastriccacerati an esablih a arly dnostic dlo identifin sae I srcacer prelinrilMethods：Serum sapls om 9 gastrccance patiets and 83 e and endermtched health ndiduals wernaly by SELDIOFMS PrteinChiprr echnologyhe rsultng SLITF- specral dtawer analyzed nghe Biomarkeizar TM ndBioarker PatrnTM sftware to f difenal prtin and dvelp clasfiation tre for gatric carcerRsults：A toa of 34 msseaksweeidetifid.Sixpeaks at mass:charg raios（nV）of873， 163,526，5762，61 and 7778 ee used to cosructthe dinsic model 。The ml Iculd effectively distinis gastricane-samle frm onol ample，ahieing a enstvt a spifii够of 9349and 957%,epecvl。In adion,we entified thre of hesi ein peaks at 2873,611and 7778z,whic coldonsruct te inostcmdel I。Te modelI ol distingishbtween stae I gastricaner and tage II/II/ gstr alleT wim allacurac f 9 1。72%。Coclion:Danosticmodelof srumprotns dects by SELDIO PrteinChiara tehology crrectly singshastri Cangrom cotl，and hs significncefr sreingstage Iastri cafeT from stageI/gastric canrSI D-FOFM i a usefu toofo he deecin and nficaton of erotmkers。e word：gasti nce omarkers SEDI-OF-MSem Prtemic Patterns引言引言胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，在世界范围内为第四多发恶性肿瘤和第二 致死性肿瘤，值得注意的是几乎近三分之二的胃癌发生在经济欠发达的地区或国家,包括中国n喇。近年来，虽然随着上消化道造影、内镜活检、术前新辅助治疗、术后 综合治疗等诊疗水平的提高，胃癌五年生存率有所提高,但效果仍欠理想。据报道， 早期胃癌(I期胃癌）五年生存率可达829%、期胃癌62。8、III期胃癌78、IV期胃癌3%，总体五年生存率2左右口嘲。一般认为影响胃癌预后的主要因素是 肿瘤的分期，分期越早，预后越好；早期诊断胃癌是最有效降低死亡率、提高治愈 率的方法.因此，有必要对早期胃癌诊断的方法进行探索和研究.目前,内镜活检、手术切除肿瘤进行病理学检查被认为是胃癌诊断的金标准， 但这种技术具有诸多弊端,其缺点如耗费时间长、费用贵、给病人带来诸多不适, 更重要的是，很多病人得到明确诊断后,即发展成进展期胃癌甚至晚期胃癌，治疗 效果较差：此外，内窥镜活检送病理或手术切除后送病理无法制定人口众多的筛查 方案睁”。因此，有必要探索研究创伤小、费用低、便于筛查，具有高度特异性和灵 敏度的肿瘤标志物进行早期胃癌的诊断.自进入0世纪8年代以来,人们已经开始在胃癌患者外周静脉血中寻找与胃癌相关的生物标志物,以期能够对早期胃癌进行尽早诊断。目前发现与胃癌相关的肿瘤标志物主要有癌胚抗原（CEA）和糖链抗原19。9（l99）、12(A25)、2（C22）、50（A0）等睁3.但这些指标敏感性、特异性均较低，尚不足于用来进行早期胃癌的 诊断。最近大量研究表明，单个肿瘤标志物尚不足用于早期肿瘤的诊断,有不少学 者利用多个肿瘤标志物组成一个蛋白质组诊断模型进行全身多个系统肿瘤的诊断, 比如肝癌1刳、卵巢癌H”、乳腺癌n蝴、肺癌乜4删、前列腺癌嘲训、膀胱癌2刊、胰 腺癌1、食管癌明大肠癌1等疾病的差异蛋白质组学研究中发现多种疾病相关的候 选蛋白标志物。关于胃癌肿瘤标志物的研究也有所报道，只是目前所报道胃癌相关 标记物临床价值具有不确定性,这一方面反映了许多研究规模较小，纳入病例数偏少,随访时间较短，统计学报告差;另外目前报道的研究大多数分析单一肿瘤标记 物的临床价值,对联合应用几种标记的组合分析不足。所以，还需要高质量的设计 科学的多中心试验以得出可靠的结论，急切需要迸一步研究。近几年，新兴的表面增强激光解吸电离一飞行时间质谱（surface enhand 1aseesrton/ionizatiotimeo lghmss sectometry tehnolgy， EDI-TOFMS)技术为差异蛋白质组学研究提供了一个十分理想的平台，同时也为全 身多个系统肿瘤标志物的研究提供了一个理想的平台。SEDITOMS技术是由日本著名科学家田中耕一发明，美国Ciphrgn Bieem公司进行进一步研究并使之1青岛大学硕士学位论文商品化.该系统由3部分组成：蛋白质芯片;芯片阅读器生物信息学。该技术 的原理是芯池中的分析物在激光脉冲辐射的作用下,解析后形成荷电离子,不同质 荷比离子在仪器场中飞行时间长短不同,而绘制出一张质谱图案，可以显示不同蛋白的相对分子量等信息。(工作示意图i如下)。LI技术能快速分析、处理大量质 谱图信息，将测得质谱图与正常人或某种疾病或者疾病不同阶段的标准图谱进行对比，就能捕获该疾病不同阶段特异性的相关分子蛋白质。蛾麟辫图1 ELDF船工作示意图表面加强解吸电离一飞行时间质谱（ELITOFM)技术不同与传统的蛋白质组 学技术，有以下一些优点:(1)次可以实现上万种蛋白质检测分析，快速、简便、易行、高通量、平行分析,； （2）需样品量极少，只需5”-50个细胞所提取的蛋白 质即可; （3)较高的信噪比； ()可以对小分子量的蛋白质进行鉴定; (5)可以和基因芯片结果进行比较分析，在蛋白质组和基因组之间建立联系；（6）应用多个 未明确性质的蛋白质或肽信号可联合组成诊断模型，对全身各系统肿瘤的早期诊断 比单一的肿瘤标志物更准确可靠,敏感性特异度更高等。ELDITOFMS技术克服了 诸多传统蛋白质组学研究中无法解决的问题，实现了蛋白质芯片技术临床检测应用的飞跃。高通量的质谱技术为寻找新的标志物用于早期肿瘤的诊断和监测治疗效果， 已经成为一个临床医学研究的新方向。本课题设计总路线如下图2。图2本课题设计总路线3资料和方法第一章资料和方法11研究对象选取我院及青岛市立医院普外科09年5月至200年月连续入院的原发性 胃癌病人作为研究对象。胃癌分期标准按Ameian Joint Conunittc nCcer(7thd，2010).所有病人均为汉族，经病理证实为胃腺癌，入选病例排除标准如下:（1）年龄大于75岁;（2）患有神经性厌食、炎性肠病、免疫性疾病和内分泌疾患；（3）感 染；（4)幽门梗阻;（5）心力衰竭（心功能大于级)、肝衰竭（Child分级C级）、 肾衰竭;（6)近4个周经过外科治疗、内镜支架术、放射治疗或化学治疗;(7）经受过可以严重影响新陈代谢或体质量的药物治疗。健康人血清标本取自本院健康查体中心，排除标准同胃癌排除标准,并随访一年,无胃癌病例发生.所有研究对象入 组前均取得病人或家属的知情同意，并经过医院伦理委员会的批准。2试验材料2主要仪器1STS2脱色摇床（上海琪特分析仪器有限公司)2.震荡器MSl Minishake（广州仪科实验室技术有限公司（IK o angzhou ID：L001503。efrigrtd centrifuge(SIGMTyp：15)4。Gi so ette（上海肇嘉浜路590号）5。H etr(SARTORISPB20）6.Eecrnic Bance(rag lev)（TRIUBS210）。Tips P2，20,200，P100（XYGE）85 lvia(XGEN).05 ml，1。 mlMicrocentrfuge ube（AXYGEN)10高速台式离心机型号:TL-1(上海安亭科学仪器厂）11.加热磁力搅拌器(KARH-KTC）1U ralotemperaturefreeer(80摄氏度冰箱)（KELO型号:BC一2 19w） 13。一30.摄氏度冰箱(KEoN型号：CD-21WAK) 14自动制冰机（tmatcicemahins)（Gan：F 70）4青岛大学硕士学位论文15制去离子水机(o Mlire)（ALLMel：PL5121）16。SELDITF-MS仪器及其配套的弱阳离子交换芯片（WX2）（购自美国iphren公司)1.主要试剂 1.尿素(uea） 2乙睛（CAN)3。三氟乙酸（F)。芥子酸(SPA)三经基甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液（risHCL)6.经基呱嚓乙磺酸(HPES）.。3一环乙胺-1-丙磺酸(CHPS)8.无水aA.二硫苏糖醇（TT）(以上试剂均购自美国Sigra公司)10U的配置5ml：（9Ure，50n！TrisCl,CHAP，pH9)称取2709Ua（MW 0。06,终浓度为9）,加入PL H:O3ml和M Tri sC250u H9。0充分溶解;在上述溶液中加入CHAPS 01 g充分溶解；再用HPLC :定容至4。5ml， pH 9.0，加入DTT 005，定容至ml；分装入50ul离心管,每管ul,封口， 放入80。C深低温冰箱保存。iCX2 buffer的配置200ml：（50IIlM NaA,p4。0）称取无水NaAC 0.89，溶 入180m HPLC心中；用CI调pH40,HLC H20定容至200 ml，4C保存。12其他试剂:C,HpLHO，生理盐水等。1.3试验方法1。1标本采集与处理所有病例及对照组均于早晨抽取空腹静脉血5ml,4”静置2h，然后于”C以 3000:mn离心lmin，吸取上层血清分装,每管ul，立即置。C深低温冰箱保存.标本采集与处理示意见图1.。5资料和方法I清晨空腹母取5llII全血U4静置静置2小时Ul 4以3湖t：mi离心10m琢量吸取上层血淆分装成每管50JI立即置一簟冰箱保存，图。标本采集与处理示意图,1。血清样品处理.1。从.80深低温冰箱中取出血清样品，放置冰盒上融解；2以1，00币m，4.C离心分钟；3每个芯片点需要血清3l,将血清样品冰浴振荡0分钟并用2倍体积U9缓冲液 稀释;5将9u上述样品加入108ul相应的结合缓冲液中，使血清样品的总稀释倍数达到 约倍，混匀，避免产生气泡。6将处理好的血清样品上样到芯片上.13。3芯片的选择常用芯片包括CX（弱阳离子交换芯片)、SAX(强阴离子交换芯片)、 IMAC3Ni(固定金属亲和表面芯片）和H（疏水芯片)等化学修饰芯片。其中研究发 现【33：化学修饰的CX2芯片,有弱阴型离子羧基结合其表面，通过与被分析 物表面正负电荷基团的相互作用而捕获蛋白，所得到的蛋白峰较多,蛋白分离效果 较好,且差异明显、稳定性强。本实验通过预实验验证上述芯片，结果现示WX2芯片所得到的峰最多、蛋白分离效果最好、差异明显和稳定性强.预实验操作流程（图1).6青岛大学硕士学位论文SEL翻嚣Q雾壤瞄嘲蟛娜蛐褂Sample1溯警黧嘲炒图1。2ELDIM预实验操作流程1。34们2操作步骤1小心取出C的芯片，在芯片背后标记时间、芯片种类、人血清样品的姓 名等基本资料。将上述芯片装入生物芯片处理器(Boprocesr)中。在组装生物芯片处理器 时，注意密封。一3。在每孔中加入20ul结合缓冲液（5M NaAC，pH 4。0),置振荡器40-60转，分并震荡5分钟，再甩掉缓冲液。重复操作一次。操作时，注意保持芯片每 个点表面湿润；加缓冲液后要注意观察芯片表面有无气泡,假如有气泡产生，用取液器吹去，其枪头不要接触到芯片上各点的表面。上样,在芯片处理器每个孔中加入处理好的血清样品lOul,置振荡器40-600 转,分。4C震荡1小时.5甩出样品，然后将甩出的样品甩入预先装有消毒剂的容器内。6每孔加入结合缓冲液200ul,(50 mMNaA，pH 4)，置振荡器(40-60转，分，4震荡5分钟，甩去孔中液体，再次加入200u结合缓冲液,重复上述 操作一次。7-_-_-_-_-_l_-_I_-一。窒型塑查鲨7。每孔加入HPLC水200l,然后立刻甩出。8快速拆开芯片处理器，取出芯片待干后，在每孔上加PA .5 l，干后在重复 加.5ul一次。9待干后，即上机测定。实验操作流程示意图见图13。图1。3 SELDI-MS实验操作流程示意图青岛大学硕士学位论文.4数据的采集与结果分析:利用PBSC型蛋白质芯片阅读仪读取数据，每日用标准多肽和标准蛋白质分子校正仪器。蛋白质芯片阅读器设置如下:检测敏感度8，激光强度65,优化蛋白质 荷比范围20000000ka,最低信噪比为，每个样品收集50个点.采用omarkWizard软件分析胃癌组与健康对照组血清蛋白质谱差异，两组之间蛋白峰比较采用 t检验，确定两组之间O.0时具有统计学意义;采用BoakeWzr软件分析早期胃癌组与健康对照组、II/II/IV期胃癌对照组血清蛋白质谱差异,三组之间 蛋白峰比较采用秩和检验，确定三组之间PO05时具有统计学意义。所测数据采用 SPSSl3软件分析，计量资料以S表示，采用t或秩和检验。9结果第二章结果2。1实验对象一般临床资料根据入院纳入及排除标准，符合条件的I期胃癌47例；并根据年龄、性别相匹配的原则，随机选取I期胃癌例、II期胃癌46例、IV胃癌7例、健康人83 例作为对照组。一般临床资料见表2.1.表21早期胃癌组与对照组一般临床资料注：I期胃癌与健康人、II/IV期胃癌三组间性别、年龄无统计学意义.2。2 CX芯片蛋白质谱的重复性测定SELDITOF-MS质谱技术重复性测定用质控标本进行,分别在将同一标本、同一芯片上八个点同时检测(批内)，并且在非同日检测的每个芯片上分析(批间）,获得 蛋白峰位置批间和批内变异系数分别为0.5%和0。04%;蛋白峰标准化强度（峰高) 批间和批内变异系数分别为4和1；每日仪器操作及抽样无明显差异，本研究结 果的可靠性可以得到保证。(见图2)2湖,嘲？S00tOOO笳协5o雄抡“圳i蚓嘲矧-叫删纠一255075l嘲图21不同WCX-2芯片不同时间检测同一血清样本的蛋白质图10青岛大学硕士学位论文注:横坐标为所测蛋白质的质荷比,纵坐标为所测蛋白质的相对丰度；所用的质控 血清在不同时间、不同的WCX2（弱阳离子交换芯片）芯片进行重复性实验，显示所测蛋白质的峰值无明显变化。23胃癌和健康人之间血清中差异蛋白的检测用Biomarker izr软件对19胃癌组与8例健康人组两组血清蛋白质质谱 图进行比较，结果显示在质荷比范围20003000Da范围内共检测出3个差异蛋白 质,将差异蛋白峰导入omarr Parn统计分析软件,对胃癌组与健康人组进 行统计分析，结果发现质荷比分别为87m/z、62 m/z、4526 z、6121m、 316 mz、和777 mz的6个差异蛋白具有显著性差异（P）(表.2）,可组成的诊断模型I，可以正确地将胃癌患者与健康人分组,敏感性和特异性分别为 34%（15/169）、91%（6）。它们在质荷比横坐标上的分布如图2。2。表2.2胃癌和健康人之间血清差异蛋白的相对含量的比较注:f为胃癌血清中高表达的蛋白，胃癌血清中低表达的蛋白;胃癌和健康人之间血清差异蛋白的相对含量的比较具有统计学意义，P（ttest)05。24 I期胃癌和II/IIV期胃癌之间血清差异蛋白的检测在相同条件及参数下，对47例I期胃癌患者与12例IIIII期胃癌患者 个蛋白质进行对比研究，结果发现质荷比分别为2873、121、和778 /z的个 差异蛋白具有显著性差异（P.05)（表2。3）,可组成的诊断模型I，可以正确地 将期胃癌患者与III/I期胃癌患者分组，敏感性和特异性分别为 89.36%（447）、2.62%（13122）。它们在质荷比横坐标上的分布如图23。健康 人血清蛋白质谱分布如图2。，I期胃癌和II/IIIIV期胃癌血清蛋白质谱分布如图25。结果 表23健康人、I期胃癌和I/I/期胃癌之间血清差异蛋白的相对含量的比较注:为胃癌血清中高表达的蛋白，I胃癌血清中低表达的蛋白；健康人、I期胃 癌和III/Iv期胃癌之间血清差异蛋白的相对含量具有统计学意义,O05(秩 和检验）。图2胃癌和健康人之间血清差异蛋白的表达注:横坐标为所测蛋白质的质荷比,纵坐标为所测蛋白质的相对丰度。此图为胃癌 与健康人之间血清差异蛋白的表达。青岛大学硕士学位论文健康人、早期胃癌、II/II/V菇之间血清差异蛋白的表达ZU164魁12口健康人10侠罂8F ii/iiiIV期胃癌4T21-2873 61 f777 lm结果注：横轴代表蛋白质荷比，纵轴代表蛋白相对强度.此质谱图显示健康人血清蛋白 质谱的表达。图25 I期胃癌和III I I/IV期胃癌之间血清差异蛋白的表达注：横轴代表蛋白的质荷比，纵轴代表蛋白相对丰度。此质谱图显示I期胃癌和IIIII/IV期胃癌之间血清差异蛋白的表达。质荷比为287mz、56 m/z、45 mz、 612 m/z、16m/z、和778 /z 6个差异蛋白均在胃癌患者中异常表达;质荷比分别为8m/z、21 mz、和778 m/z的3个差异蛋白均在I期胃癌患者中异常表达。14讨论第三章讨论目前，胃癌被认为是一种多基因,多步骤的复杂性疾病,其发生发展是多个基 因突变的过程.基因异常突变有可能会引起蛋白质水平的改变;人血清是一个相当 丰富并不断变化的蛋白质系统，单一分子标记物难以追溯到相关的细胞、组织，而发现一组与特定细胞、组织癌变相关的血清蛋白质并对其进行研究有可能直接获取 疾病相关的特征性分子标志物。以蛋白质组成成分为研究对象的蛋白质组学的方法为肿瘤早期诊断的研究提供了新的思维模式。从理论上说，任何疾病在出现病理改 变之前，其细胞、组织和体液中的蛋白质成分及数量都会有相应改变。最近研究表 明，血清、尿液、淋巴液等体液中含有大量与疾病相关的特异性分子标志物，尤其 是血液中可能含有大量尚未被发现的可用作疾病早期诊断的多种分子标志物口训。3、1蛋白质组学的定义及研究方法一近年来，随着人类基因组计划全面发展及完善，后基因组计划的概念被许多著名科学家提出,并将研究重点集中蛋白质水平。蛋白质组（proeome)源于蛋白质 （Pprtein）和基因组（nom）两个词的组合,是由澳大利亚著名科学家Wilkns和Viiiam在1994年在意大利一次国际蛋白质组学研讨会上第一次提出，主要是指 细胞内所有蛋白质的存在形式及其活动方式,后来引申为一种基因组所表达的全套蛋白质，而一种基因组可包括一种细胞乃至一种生物1.目前，蛋白质组的确切定 义是：一种细胞、组织或生物体拥有的全套蛋白质,它不仅在同一机体的不同组织和细胞中不同，而且在同一机体不同生理状态、不同发育阶段及不同外界环境下也有 不同驯。蛋白质组学（proeomcs)是一门新兴的学科，以蛋白质组为研究对象，大规模、 系统地研究蛋白质的特征及微细结构m,尤其是蛋白质分子水平的研究，包括蛋白质表达、蛋白质间相互作用、翻译后修饰等,由此获得疾病发生发展过程、细胞生理生化特征和调控网络广泛、完整的认识。随着蛋白质组学研究，差异蛋白质组学 越来越受到科学家重视,并通过疾病组和对照组的比较分析，其在疾病研究中的应 用潜能得到充分展示，从而获得对于疾病发生发展及细胞代谢整体过程全面的认识 4t。蛋白质组学最大的优势是可以在实验中观察一个或一组蛋白质或蛋白质亚型在特定时间下，其在生理或病理状态所发生的相应变化H引。32蛋白指纹图谱技术在肿瘤研究中的应用蛋白指纹图谱技术最早是由许洋博士于本世纪初在中国提出，并于2004年月 在亚太地区国际肿瘤生物学和医学暨第2届国际肿瘤标志物学术会议和2005 年4月美国第9届肿瘤年会上正式报道蛋白指纹图谱技术在中国的应用.蛋白1青岛大学硕士学文论文指纹图谱仪技术的原理：芯池中的分析物在激光脉冲辐射的作用下,解析后形成荷 电离子，不同质荷比离子在仪器场中飞行时间长短不同，而绘制出一张质谱图案. 将所检测人的蛋白质图谱与正常人标准图谱相对照，分析有无差异,就知道这个人 的图谱是是否患有某种疾病，或是存有某一种或一组尚未探明的新的特异性分子标 志物。几十分钟或几分钟就可以完成整个质谱的测定过程,十分迅速，方法敏感、 特异性高，同时一般不会破坏所测定的蛋白质化学结构。蛋白指纹图谱技术通过对蛋白质动态、全程的分析观察，对疾病早期微小变化 进行探索，将病人全套血清蛋白质变化记录下来：绘制成蛋白指纹图谱就可以显示 所测样品中各种蛋白质不同信息，并将这张图谱标准图谱进行对照，就能发现捕获到与疾病相关的、新的、敏感性特异性高的血清蛋白质及特征。3.3应用SEL-TOFMS筛选结胃癌或早期胃癌血清蛋白标志物近年来，SELITOF-MS技术在多种肿瘤的研究中已经得到越来越多的应用.临 床医学研究表明，早期发现是肿瘤治疗的关键,筛选特异性敏感性高的肿瘤相关生物标志物对肿瘤的早期诊断和治疗具有重要意义。DITO-MS技术主要由蛋白质芯片、芯片阅读器和生物信息学3大部分组成，具有操作简便、检测快速、多样本检测、灵敏性和特异性高等优点.根据美国国立肿瘤研究所多中心的三期临床试验得出结论：SLDTOFMS技术是目前最有希望的对肿瘤进行早期检测诊断的技术。在 蛋白质组学研究中，蛋白质的分离技术、质谱技术和蛋白质数据库的进步完善，将 对早期肿瘤进行诊断的研究有着重要作用。本实验结合蛋白质组学技术和蛋白指纹图谱技术,利用SELOS技术对实 验组I期胃癌47例、对照组I期胃癌9例、II期胃癌46例、IV胃癌3例、健 康人3例血清样品进行蛋白检测，结果发现质荷比分别为287mz、5762 m/z、526m、6121 mz、36 m/、和778mz的个差异蛋白指纹图谱具有显著性差异(PO。01），可组成的诊断模型I，可以正确地将胃癌患者与健康人分组，敏感性和 特异性分别为939(581)、91。57（76/83)。除此之外,更重要的是6种蛋白质中其中3种质荷比为2873mz、61 mz、和78 m的个差异蛋白指纹图谱 具有显著性差异可组成的早期胃癌诊断模型I，可以正确地将I期胃癌患者与IIIIIIV期胃癌患者分组，敏感性和特异性分别为8。6%（447）、92。6(11322）.我们还需要进一步多样本多中心验证我们的胃癌诊断模型和早期 胃癌诊断模型，希望能尽快推向临床应用.一、t H蜘等学者报道了2046 m/，3179 m/z，181 m/，1725 m/z和192m/z五种蛋白质组成的胃癌诊断模型，可以把胃癌组与正常人分组,且一个质荷比为16讨论46m得蛋白质可以把II期胃癌和IIIV期胃癌分组,敏感度和特异性分别 为91%( 2)和954%（1/22)。此报道与我们的研究结果有所不同，其原因可 能是所检测的分子量范围不一样，他们分子量范围(1500“2,00 m/)不同于我们 的(2，0030，0 m）.Matas等人运用SELDIOFS技术建立早期胃癌诊断 分类树,敏感度为88(/9),病例数较少,但也为我们大样本、多中心的研究指明了研究胃癌早期诊断的方向。uH3等学者运用类似技术也建立了胃癌诊断的蛋 白质模型，敏感度、特异性均较高，他们所用芯片为SAX不同于我们的wcX一2,目 前对于那类芯片好尚没有权威性定论，我们通过预实验比较,选用WCX一2芯片蛋白 质谱表达更清晰。Lian呻等学者证明通过研究蛋白质组学技术建议蛋白质模型可以 正确把胃癌及正常人分组。我们的研究不仅把胃癌与正常人分组，更重要的是也对 早期胃癌与i/iiv期胃癌分组，可以对早期胃癌进行诊断,从而提高胃癌治愈 率，改善预后.本研究采用回顾性及前瞻性队列研究，立足于整体角度,对目前报道的肿瘤标 志物在主要人肿瘤中以单一或新的组合形式进行大规模验证，筛选，进一步采用血清蛋白质组的方法试图寻找新的肿瘤标记。建立以血清蛋白标记为主的人恶性肿瘤早期诊断，分子分期指标体系与相关标准，国内外未见类似大规模的研究报道.我们 使用ELDLTOMS研究人恶性肿瘤血清特异蛋白标记，系统筛选相关标记物及其组 合，将可以提高诊断的准确性.有可能发现更加精确和可重复的诊断方法，从而筛 选出用于人恶性肿瘤早期诊断的方案。对这些分子的纯化、鉴定等深入分析可以更 深入地了解肿瘤发病机理，同时为药物、生物治疗肿瘤提供重要的耙点选择和理论支持。人恶性肿瘤的发生、发展及转归常常与该肿瘤胚胎发育和胚胎细胞与组织分化程度有关.目前临床上存在分期与分型一致但治疗效果不同的情况,通过大规模系 统筛选将在传统方法基础上发现与临床治疗效果相关的可能具有不同发病机制的肿 瘤新型分类标准，更注重肿瘤质的改变，建立新型人肿瘤的分子定义，特别是引入耐药基因检测，从而对肿瘤个体化治疗以及发病机制的探索更具有重要意义；并将是 制定新的肿瘤分期方案，提高人肿瘤治疗效果的重要依据。新型标记及其新组合的 临床意义的发现对包括成人恶性肿瘤在内的所有肿瘤的研究将具有重要启示价值。3。4面临的闯题与展望近年来，各国著名科学家包括不少诺贝尔获奖者，对肿瘤在分子生物学方面的 行为、特征进行了大量的研究探索，取得了多项非常有价值的研究成果，但这些研究成果在降低肿瘤发生、降低肿瘤引起死亡等方面效果不显著。美国肿瘤学界曾经公 布一项权威性的比较研究,显示自上世纪0年代以来，虽然不断有新的早期肿瘤诊17青岛大学硕士学文论文断和检测治疗效果的方法问世,但是全世界早期肿瘤诊断率及肿瘤致死率并没有显 著改善。.表面加强解吸电离飞行时间质谱（SELDITOF_S)技术在早期胃癌诊断的差异蛋白质组学研究中,虽然优于传统的蛋白质分析技术，但在临床实际运用中仍面临 严峻挑战，其不足如下：不能对所检测的蛋白质直接进行鉴定,对蛋白质性质、空 间结构、功能等研究仍需要依赖传统的蛋白鉴定技术,如激光解析离子化质谱仪、 生物信息学、二维电泳、基质辅助等.质谱信息的分析处理及分子生物信息学的广泛应用还有待进一步研究，芯片制备质量均一性、质控方面及实验重复性评价等问题的研究还有待完善。随着芯片技术、质谱分析技术及蛋白质分离纯化技术的发展， 以及在研究方法上新的突破和分子生物信息学工具的不断完善，在更高水平上寻找新的肿瘤相关功能蛋白组和标记物成为可能，从而在肿瘤发生机制、诊断、分期和 治疗效果检测中取得重大突破，同时也为探寻新的诊断方法和治疗靶标提供有力依据,也为胃癌的研究、早期诊断和早期治疗带来新的曙光。通过差异蛋白质组学的 研究,寻找和确立一组早期肿瘤相关的蛋白质特异性分子标志物，这些分子标志物将 有可能成为发现早期肿瘤的“利器。结论结论=口 ,匕本研究提示:利用SELD-OF-MS技术在血清中可以筛选到诊断胃癌的特异性蛋 白质标志物，该方法在胃癌诊断尤其早期胃癌诊断方面具有重要的价值，为早期胃癌的诊断指明研究的方向。19参考文献参考文献1YngL，Prkin DM，Ferlay J,L L，Cen 。Estimas of ancer idence in ina for000 and prjectio for2005 Caner Epidemol Biomarers Prey。 05 Jan，14(1）:24- o2Yan nidncendmortalty of astric ance in in.Worl 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