染色体标本制作与观察实验报告

实验题目】染色体标本制作与察看【实验目的】1、掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和 Giemsa 染色法，认识各操作步骤的原 理。2、认识常用实验动物染色体的数目及特色。3、认识不一样生物染色体的特色，学会做染色体组型图。【实验资料与用品】器械：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、离心管、离心计、 小烧杯、冰箱、酒精灯、小烧杯等资料：小鼠试剂：蒸馏水、NaCl溶液、KCl溶液，固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、秋水仙素【实验原理】一、制作染色体标本的先决条件 细胞拥有旺盛的分裂能力：选择活跃的组织，如胸腺、骨髓、睾丸、小肠；或施加药物 使细胞分裂（PHA）想法获得大批的分裂中期细胞：利用秋水仙素二、染色体 染色体是基因的载体。真核细胞染色体的数目和构造是重要的遗传特征之一。 制备染 色体标本是细胞学最基本的技术之一，优秀的染色体系片是进行染色体显带、组型剖析、 原位杂交等的先决条件。染色体的制备在原则上能够从全部发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中获得。 最常用 的门路是从骨髓细胞、血淋巴细胞、和组织培育的细胞中制备染色体。 本实验采纳的方 法是从小鼠的睾丸细胞中获得。染色体的形态构造在细胞增殖周期中是不停的运动变化的， 一般在有丝分 裂中期，染色体形态最典型、最易辨识和划分。所以，制备染色体标本获得的是中期细胞。染色体特色：数目、长度（绝对长度、相对长度）、着丝粒地点（ M/SM/ST/T）、 随体与次缢痕的数目大小和地点、带型剖析描绘染色体的四个参数 ： 相对长度二（每条染色体的长度）/ （单倍常染色体之和+X染色体）* 100,相对长度可以用来表示每条染色体的长度。 臂指数二（长臂的长度）/（短臂的长度），臂指数能够用来确立臂的长度。着丝粒指数二 （断臂长度）/（染色体全长）*100，着丝粒指数能够决定着丝粒的相对位染色体臂数（NF），依据着丝粒的地点来确立。三、操作原理小型动物的染色体系片最好最有效的资料就是骨髓组织（因为分裂活动旺盛，睾丸也可）利用 睾丸细胞的制片技术固然需要离心以及仔细的操作，但基本程序其实不复杂。在小鼠睾丸中，细胞 有丝分裂和减数分裂比较旺盛，所以不需要体外培育就能够直接获得分裂中期细胞。经过小鼠睾丸 获得染色体比较简易，一般不需要无菌操作。用秋水仙素作为有丝分裂的克制剂，将其注入到小鼠 腹腔中，能够阻挡分裂细胞纺锤体的形成。因为小鼠睾丸细胞分裂活动旺盛，拥有高度的分裂能力，本次实验经过前办理、低渗、固定、 制片染色等步骤制得染色体标本，可察看到很多处于分裂中期的染色体，能够进行染色体组型剖析Giemsa 染色法的染色结果：细胞核染成紫红色、细胞质和核仁染成蓝紫色四、制作染色体标本 的意义认识染色体的特色（形态、大小、数目）绘制染色体组型图染色体组型：把真核动物一个体细胞各染色体按长度、形状、着丝粒地点摆列成必定次序。染色体核型：某一物种独有的一组或一套染色体的形态特色。染色体组型图的应用鉴识生物种类：兔条；狗 78 条；马44 条；小鼠 40 条；大鼠 42 条；鸡 78 条；猫 3864遗传病的诊疗和研究：三体综合征（含三条21 号染色体）、卵巢退化症（含45条染色轍鸡脱紀裊糁兑緒發淶雜达愦牆饺。体，比正常人缺乏一条性染色体）、睾丸退化症（含47条染色体，比正常人多一条X或Y染色体）等。所以，我们能够给孕妇抽取羊水检查器胎儿的染色体，做遗传病初期诊疗。 染色体标本的制作1）PHA：促细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变成淋巴母细胞2）秋水仙素：损坏微管装置，使纺锤体不可以形成，大批细胞停止在分裂中期3）低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体间距拉大，易于分别开4）空气干燥：使细胞和染色体睁开5）固定：用carnoyssolution（甲醇：冰醋酸=3：1）作用使蛋白质变性，关于染色体内的组蛋白来讲，变性后硬度增添，保持了染色体的即时形态，对细胞膜蛋白来讲， 变 性使细胞膜硬度加强。形成屏障作用，防备了细胞内物质外溢和丢掉。6）视线中染色体可能是 20或40条左右，因为细胞可能处于减数第一次分裂和减数第二 期分裂期间。【实验步骤】一、小白鼠染色体标本制作步骤（1）取雄性小鼠，以每克体重4ug注射秋水仙素，14-16h后，用断头法处死小鼠，取出睾丸用生理盐水（NaCl溶液）洗去血污。（2）将睾丸放入装有%KCl溶液的小烧杯中剪碎至液体呈乳白色。（3）用铜网过滤到刻度离心管中，再加%KCl溶液至4mL。（4）37C静置30min,低渗办理。（5）以 800T000r/min 离心 8 分钟。（6）弃上清液，加入2mL甲醇冰醋酸固定液（3:1），并用吸管至管底吹气，轻轻打散细胞，固定8min。（7）再以800T000r/min 离心8分钟。（8）弃上清液，加入ImL甲醇冰醋酸固定液制成细胞悬液，固定5min。9）取去干净的低温预冷载片，取出后立刻用吸好细胞悬液的滴管在距载玻片 10-15cm的高度滴下 2-3 滴细胞悬液，从载玻片一边向另一边轻轻吹气， 同时轻轻敲打载玻片，以使细胞平均散布，促进染色体睁开。（10）用滤纸擦去载片上的剩余液体，空气干燥。（11）用 Giemsa 染色 20-30 分钟，细水流反面冲刷载玻片以洗去剩余染液，自然晾干。（12）镜检。低倍镜下找寻分别优秀，染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下察看染色体形态，找各处于细胞分裂中期的染色体。【实验结果与剖析】I. 实验结果图 1:40 倍镜下察看染色体组 图 2:40 倍镜下察看结果实验剖析结果剖析：本实验采纳的是小鼠的睾丸细胞，在40 倍镜下察看，视线中可见很多未成熟的精子 （如图 1），此外能够找到好多处于分裂间期和先期的染色体，其凝聚程度不是很高；分 析可知，处于减数第一次分裂的中期的细胞是二倍体，可察看到 20 对即 40 条染色体，有 些在进行减数第二次分裂中期，这样的细胞是单倍体，应有20 条染色体。察看中会出现少于20 条染色体的状况，或很多于 20条少于40条的状况，可能原由： ）在制备细胞悬液过程中有染色体的丢掉。如用吸管吹散细胞时使劲过大造成细胞破裂， 使得染色体弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢掉。）在距离载玻片必定高度滴片刻因高度过高，使得染色体过于分别而致使丢掉。 ）滴完片在敲打载玻片的过程中致使染色体的丢掉。4）染色时，因为在染液中染了 30min,部分染色体可能会随染液丢掉。实验中没有察看到完整睁开好的染色体， 染色体大多呈棒状而不是 V 字形，这说明在 对染色体展平的步骤没有做好，此后应改良。做好本次实验的重点步骤：1）低渗办理过程。低渗溶液的量、办理时间均与细胞的数目相关。低渗过分，细胞会破 裂；低渗不足则染色体聚在一同分别不开。2）离心速度以及离心时间也能影响染色体标本的制备。离心速度过大或离心时间过长 , 则会惹起细胞破裂；反之 ,离心速度过小或离心时间太短 ,则细胞沉降不下来,则会惹起大 量细胞的丢掉。3）固定液要随用随配。固定完全后再打散细胞团块，不然细胞简单破裂，染色体分别亦 遇到影响。4）用吸管吹散细胞时使劲一定尽量柔和。使劲过大则会造成细胞破裂，而染色体也会弥 散在溶液中,在随后的离心中将会丢掉。5）载玻片要预冷。取出早先冰好的载玻片后要立刻滴加细胞悬液， 这就需要在拿载玻片 以前先用滴管吸好液体，若玻片的冷却温度不够，则会影响染色体的附着和铺展。 滴片刻的高度很重要。高度过低细胞不会破裂，过高则染色体过于分别甚至丢掉,没法鉴识出染色 体的正确数目。在察看中还发现，视线中细胞不是很分别，存在大批细胞团，这能够归纳为多方面 原由。第一，假如在剪碎组织时没有剪好，则会致使细胞匀浆中含有大批细胞团，因为这些细胞齐 集在一同，就有必定的组织强度，十几厘米的高度很难摔碎。其次，假如低渗不完整，细胞可能膨胀程 度不够，很难摔碎。再次，假如混匀细胞时没有完整混匀，则会导致细胞齐集在一同，敲细胞时很难敲碎，相同察看不到理想的成效；假如吹得太使劲，则会致使细 胞被吹碎，视线中有大批细胞碎片，影响察看。最后，假如滴片刻的高度不够，细胞分别不好，也很能破裂，染色体也就不可以很好地睁开。【注意事项】1、注射秋水仙素：应选择腹腔注射，假如察看到小鼠被注射后皮肤隆起，则表示注射到 皮下，应从头注射；假如在拔出针时察看到有血珠溢出， 则是因为注射时损害了部分器官 或血管，秋水仙素会随血液传达到浑身，其传达速度会加速，其死亡时间可能小于15-16h, 应随时察看小鼠，以防其忽然死亡。即便注射到小鼠的腹腔中，也很有可能注射到起脂肪 组织中，使小鼠的死亡时间变慢。所以应依据详细实验，适合调整注射时间和等候时间。2、处死小鼠：最好选择在小鼠将要死亡时处死小鼠，因为此时，秋水仙素的作用发挥到 最大，分裂期中期的细胞最多；假如等小鼠死亡后处死小鼠，小鼠尸体可能已僵直，难以 取到精巢。3、剪碎组织：能够取少于KCl溶液，没过杯底即可，假如液体太多则很难剪到组织，比 较浪费时间。4、铜网过滤：应把组织尽量剪碎后再用铜网过滤；假如烧杯中仍有较大颗粒，则当心不 要把那些颗粒倒出，在烧杯中再加入少许 %KCl 溶液，持续剪；假如铜网上还有好多比较 大的颗粒，先用少许%KCl溶液将其冲进烧杯，再进行剪碎。5、实验步骤中的（4）所提到的 30min 包含（5）中的离心配平常间，所以，真实的静置时间应少于30mins，细胞与%KCl接触的总时间应为 45mins左右。6、离心：离心的转速是800-1000r/min，这样低的转速是为了防备细胞破裂。7、再次离心和固定：这样做是因为第一次离心以前细胞经过了低渗办理，固然抽去了上 清液，可是不行能抽干净，所以，再次离心保证细胞走开低渗环境。8、吹散细胞：应当轻轻地吹细胞，假如太使劲会致使细胞破裂。9、摔碎细胞：摔碎细胞时应注意滴管与载玻片的距离，假如距离太小， 则细胞很难摔碎 不会察看到染色体；但假如距离太大，会使细胞完整的碎开，染色体充满视线，固然察看 到染色体，但不可以明确分出哪些是同一个细胞的，会给计数造成必定的难度。10、染色：染色以后应冲去染液并晾干，注意使用小水流并从反面冲刷，这样能够防止冲 去细胞。