叶绿体蛋白的提取

一.样品的制备1. 样品的处理(包括CK和TRE)用20%的PEG-6000 (渗透势大约为T.88MPa) 诱导干旱胁迫(D)，直到它们的相对含水量达到83%-86%(一般 3天)。然后高温胁迫(H)处理在光照培养箱中进行，温度40C 处 理时间为24个小时(恢复0h:R0)。然后R12，R24, R36,髦。DH 处理前，R0, R12，R24, R36, R48: CK,CK+TRE,CK+DH,CK+TRE+DH;DH处理后，取第3片全展叶为试材，进行叶绿体蛋白组的分析。每个处理重复 3 次。(CK,CK+TRE,CK+DH,CK+TRE+DH)2. 叶绿体的分离(1) 剪取10g小麦叶片，将叶片剪碎，液氮研磨；加入 5 倍体积 4C预冰冷的 buffer A(buffer A： 50mM Tris-HCl, 20mM EDTA 0.5M蔗糖，0. 25M Vc, pH3.5)，匀浆用8层医用纱布 过滤滤液至预冷的50mL离心管中，弃残渣。(3) 滤液1500g / min, 15min离心，弃上清，留沉淀。(4) 向沉淀中加入3mL bufferA,充分悬浮，转入10mL离心管中。(5) 2000g / min, 15min离心，弃上清，收集沉淀。(6) 加入 2mLbufferB,充分悬浮。(buffer B： 50mM Tris-HCl, 20mMEDTA, 0. 5M蔗糖，1%BSA, 7mM 蹄基乙醇现用现加)(7) 1500g / min,离心10min,弃上清，收集沉淀，再用bufferB 洗一次。(8) 同上离心，弃上清，再加bufferC洗一次，离心，沉淀大部分 为叶绿体。(buffer C： 50mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA，0. 5M 蔗糖)3. 叶绿体的纯化(1)制作不连续的percoll密度梯度，先在超速离心管中加入3mL 的60%的percoll，然后沿管壁缓缓加入4mL的40%percoll，最 后加入 5ml 20%的 percoll。Percoll 浓度(% )706050403020比重 g/ml1.0901.0771.0671.0561.0431.031问：请问percoll连续梯度怎么配制？比如15%75%的percoll连续梯度？答：根据你需要的具体密度梯度决定的，根据要分离 的不同细胞种类，数量等等，也有用原液配的。也有用80%配的， 不一定的。另外，percoll本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液 配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂。一般是 先用9份Percoll与1份8.5% NaCl或1.5M PBS混合达到生理性 渗透压，然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀释到所需 浓度。即取Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9： 1的比例混合， 此时溶液 为100% Percoll，比重是1.127。(2) 将粗提出的叶绿体加入离心管中，8000g / min离心lh。在20%和40%之间是一些密度较小的细胞器或破碎的叶绿体， 在40%和60%之间是纯化的叶绿体，在试管底部还有一些沉淀。用注射器扎入40%和60 %的界面，吸出叶绿体。(4)加入等体积的 bufferC(50 mM Tris-Hcl pH8. 0, 20 mM EDTA, 0.5 M蔗糖)，10000rpm离心5min，再用bufferC洗一遍，沉淀即 为纯化的叶绿体。4. 叶绿体纯度的鉴定4. 1显微镜观察用bufferC将叶绿体溶液稀释lO倍，滴到载波片上，可见光下观 察叶绿体形态、紫外线下观察叶绿素荧光，比较叶绿体和叶绿素荧 光重叠程度。(荧光显微镜)4. 2特异酶检测过氧化氢酶活性的检测：先用BCA法测蛋白浓度，然后用过氧化氢 酶检测试剂盒检测5. 叶绿体蛋白的提取及溶解(1) 纯化的叶绿体(10g 片)加入 1.5mL Buffer(100mM Tris，100 mM edta，50mM borax， 50mM Vc， 1 %TritonXT00，2% 伙巯基乙醇， 30%的蔗糖)，将纯化的叶绿体剧烈悬浮，室温5min。(2) 加入等体积Tris饱和酚(pH8. O)，剧烈震荡10min。(3) 4，15000g离心15min，将上层的酚转移到新的试管中。(4) 加入5倍体积的硫酸铵饱和甲醇沉淀蛋白，-20r, 6h。(5) 15000g, 15min, 4笆离心。用冰甲醇洗一次，冰丙酮洗三次沉淀， 每次洗涤15000g, 4C 5min,最终沉淀在空气中干燥。6. 用BCA方法测定蛋白浓度。7. 双向电泳7.1 IEF7.2 SDS-PAGE8. 双向电泳凝胶的固定及染色将凝胶放入400 ml固定液中固定3h。超纯水振荡洗涤三次，每次 20山加。加入400 ml预染色液，预染色l小时。加入400 ml考马 斯亮蓝染色液，染色3天。超纯水洗涤两次，每次5 min，10%冰 乙酸水溶液中保存。9. 差异蛋白比较和鉴定