LC480-Software1.5中文说明书维护SOP-2009-3-10

精心整理LightCycler480荧光定量PCR仪操作规程1 每次反响最终一步都必需做降温，降至40度，维持至少30秒。2在操作过程中，切忌戴有粉末的乳胶手套接触光学透性封板膜。3试剂加完样，封膜完毕后，在板式离心机中1500g3000rpm离心两分钟，以解除气泡。4先开电脑在开仪器，先关仪器再关电脑。翻开总电源，翻开连接LightCycler480荧光定量PCR仪的电脑，并翻开LightCycler480 Software软件，然后翻开LightCycler480仪器前方的电源开关，此时仪器会在与电脑软件接通后进展自检，仪器正面右边两盏桔黄色的灯会闪耀。自检完毕后，左边的灯会变绿，右边的灯仍为桔黄色。这时按一下灯右边带双箭头的开关，仪器的载板器会自动伸出，将打算好的反响板放入载板器中反响板的切角方向应与载板器的切角方向相应才能将反响板正确放入，切勿用裸手接触反响板的光学透性封板膜。再按一下带双箭头的开关，仪器的载板器会自动缩入仪器内，此时仪器能自动检测到反响板，原来呈桔黄色的灯会变绿，LightCycler480 Software中Start Run按钮也同时变为激活状态。5设定完试验程序并编辑完样本后，点击软件中Start Run按钮，运行试验。6软件界面上出现Run Complete.标识时，说明试验运行完毕，按一下仪器上带双箭头的按钮，使载板器伸出，取下反响板，再按一下带双箭头的按钮，使载板器缩回，关闭LightCycler480仪器前方的电源开关，在电脑上分析试验数据。7分析完试验数据后保存结果，打印报告，并关闭电脑，关闭总电源。试验员在离开PCR扩增区时带走用完的反响板。维护SOPLightCycler 480是一台免维护的仪器。做任何维护工作前，须确认主机电源已被关闭。预防性维护：1 检查LightCycler 480主机两侧与背后空间，确保无任何阻碍空气流通的物品，包括书本、纸张或其他任何物品；2 假设主机外表和桌面有灰尘，用不起毛的软布蘸少量清水擦拭干净。清洁性维护：假设有须要，可用性质温柔的商品化清洁剂或70的乙醇溶液对LightCycler 480主机外表、热循环96孔模块和热盖进展清洁。清洁96孔热循环模块：1. 用移液器移取125l 70乙醇溶液或异丙醇至全部孔内；2. 15分钟后，运用移液器对孔内溶液进展屡次吹洗；3. 移除孔内的液体，并使96孔模块孔内自然风干；留意操作时不要让清洗液腐蚀热循环模块的涂层。LightCycler480 Software 1.5软件操作中文版 第一局部 根本界面及图标概述：一、 Overview界面 Exit：关闭LC480软件 Log off：从目前运用的数据库中退出并可登陆其他的数据库 Overview：点击该图标进入“Overview”界面 Navigator：点击该图标进入“Navigator”界面，可进展数据的导入导出等操作，详见。 Save：点击该图标进展保存 Export：导出当前翻开的文件 Close： 关闭当前翻开的文件 Print： 打印当前翻开的窗口 Tools：翻开“Tools”界面，可进展密码修改，建立和编辑用户，系统设置，查看数据库状态、仪器状态、滤光片组合等操作 Help：查看软件版本，操作说明书等二、New Experiment 界面 Run Module：编辑、运行或查看PCR程序及查看PCR实时数据 Subset Editor：点击该模块后可进展子集的编辑 Sample Editor：点击后进展样品信息的编辑 Analysis Module: 点击进展结果分析或查看已保存的分析结果 Report Module：选择须要的内容以报告的形式给出结果 Summary Module : 查看试验的总体概况，包括试验名称，所用的程序，检测模式，滤光片组合等。概况的内容由系统自动生成三、Navigator 界面 Import：导入一个文件 Export：导出一个文件 Batch Import：导入一批数据 Batch Export：导出一批数据 New：新建一个试验或文件夹 New Folder：新建一个文件夹 Open：翻开一个文件 Rename：重命名 Delete：删除选中的目标 Copy： 拷贝选中的目标Note：全部上述图标在深蓝色时为激活状态，灰色时为灭活状态也就是不行用状态。各图标的功能在不同状态下以颜色来区分是否具备。软件操作一翻开软件 翻开电脑，Windows操作系统的用户名为operator，密码为LC480区分大小写，电脑操作系统启动完毕，检查电脑右下角是否有图标。假如没有，点击桌面“Exor4 for XDMS_R”快捷方式文件。然后右键点击图标，左键点击“Show”一栏，如最终一句话显示“Exor 4 server is running”表示数据库加载胜利。假如显示“Exor 4 failed to start”那么表示数据库没有加载上，关闭该窗口，右键点击图标，选“Shutdown”一栏，退出数据库，重新点击桌面“Exor4 for XDMS_T”文件，加载数据库。 然后点击桌面“LightCycler480 Software”快捷方式文件，运行该软件。输入用户名和密码。用户名默认为admin管理者权限，密码为LightCycler480区分大小写，如用户已经建立新用户名，那么可以遵照新用户名登录。二用户管理为了试验结果的有效管理，可以建立不同级别的用户。如: 标准用户Standard User、专业用户Expert User、管理者Local Administrator。一般试验室建议建立专业用户Expert User用户名，然后以该用户名登录软件进展试验操作。 建立新用户操作：翻开LightCycler480 操作软件，点击右侧按钮翻开“Tools”工具栏，选择“User Access/Users and Groups”选项。在右边窗口中点击“New User”键，在右边“Enter the users full name”一栏中填写用户的全名，在“”Enter the name the user wants to log in as”一栏填写用户登录名，在“Enter the users password”一栏中输入密码密码须含有6个以上字母，1个以上数字，其中有至少一个字母大写，在“Confirm the password”一栏中重新输入一次密码，加以确认，在“Select the users role”一栏中选择用户级别，然后点击右下方“Close”按钮加以确认。 在 “Tools”工具栏中的“System Settings”界面中可以设置各用户级的权限，以及密码的时效。三仪器自检每次开机时，仪器会自动进展初始化自检程序。自检通过，仪器左侧指示灯变绿。如放置了样本，仪器右侧指示灯变绿。在自检时，不能放置反响板，否那么自检无法通过。四建立试验程序 翻开LightCycler480 操作软件，胜利登录后点击按钮，进入New Experiment/Run Protocol程序设置界面。在“Detection Format”一栏中选择所运用的荧光检测技术，可选择各类探针和染料，如常见的SYBR Green I染料、Mono Color Hydrolysis Probe单色TaqMan水解探针、Multi Color Hydrolysis Probe多色TaqMan水解探针。在进展多色荧光PCR试验时，须点击按钮选择用户所采纳的荧光检测通道，点击“”确认。 在一栏中填写反响体积。在“Programs”界面中设置试验程序：在“Program Name”下方命名程序，“Cycles”一栏内填写该程序的循环数，在“Analysis Mode”一栏选择该程序的分析模式。定量分析选择“Quantification”，溶解曲线分析选择“Melting Curves”，颜色补偿试验选择“Color Compensation”。而后在“Temperature Targets”界面内设置所指定程序的内容，在“Target()”处填写目标温度，“Acquisition Mode”处选择信号采集方式，“Hold”一栏填写该温度所持续的时间，“Ramp Rate(/s)”处填写升降温速率注：如目标温度为50以下时，为了削减硬件的损耗，必需将降温速率调至1.5/s以下。如一个程序有多个步骤，那么在Temperature Targets界面的左侧处点击，增加步骤；也可点击上下箭头调整各步骤的先后依次。如一个试验中有多个程序，也可在“Programs”界面左侧点击，增加程序，也可点击上下箭头调整各程序的先后依次。试验程度设置完成后，在下方“Overview”界面内会自动生成温度随时间改变的温控曲线，以及估计的运行时间，绿色点表示采集荧光信号的温度和时间点。可以依照该图检查一下程度设置是否正确。设置好的试验程序可以保存成模板文件，下次运用同样的试验程序时可以调用。详细操作如下：点击按钮右侧的下拉箭头，选中“Save As Template”选项，系统默认将试验程序模板文件保存在所登录的用户名下“Templates”书目中，用户可将其存放在其下的子书目“Run Templates”下，填写该程序模板文件的名称，点击“”按钮即完成保存。调用模板程序时可点击“Apply Template”按钮，从书目树中选定所要调用的模板，点击“”按钮确认。五样本设置1、样本亚组编辑：LightCycler480软件拥有一个独特的样本编辑管理功能亚组编辑Subset Editor，即将反响板上全部的样本依据用户须要分成亚组，对亚组进展独立地分析定量。详细操作如下： 在“New Experiment”界面中，点击左侧按钮，进入Subset设置界面，点击按钮新建亚组，并给其命名。点击按钮可复制所选定的亚组，点击按钮可更改所选定亚组的名称，点击“Delete”按钮可删除所选定的亚组。设置亚组：在Subsets界面中选定要设置的亚组名，在右边反响板孔位处选定该亚组所包含的孔位，使所选定的孔位中都出现深兰色凹陷的，点击下方按钮加以确认。设置亚组可以在一块反响板上实现多个检测工程的试验，前提是这些检测工程的试验运行程序都一样这在运用TaqMan水解探针时比拟简洁实现，由于各检测工程均有各自的质控参照，因而，设定亚组可以单独对各检测工程进展分析。2样本属性编辑点击New Experiment界面左侧按钮设置样本信息。在“Workflow”一栏在选择试验方案：Abs Quant：肯定定量或定性分析；Rel Quant：相对定量；Scanning：基因扫描；Color Comp：颜色补偿；Tm：熔解温度检测；Melt Geno：熔解曲线法基因分型；Endpt Geno：终点法基因分型。 在Select Samples/Subset选项中选定待编辑的样本亚组： 在界面右方编辑各样本的名称属性等：Pos：样本在96孔板或384孔板上的座标位置；Repl Of：重复样本设置；Sample Name：样本名称；Quantification Sample Type：定量样本类型；Concentration：浓度；Target Name：检测类型。 在进展肯定定量检测试验时，参加试验的样本有标准品一般4至5个、阴性参照、阳性参照、未知样本。各样本的名称可参考以上“Sample Name”中的命名习惯STD表示标准品、NC表示阴性参照、Positive表示阳性参照、Sample表示待检测的未知样本，也可以自行编辑。 在“Quantification Sample Type”一栏内须要对各样本的类型进展明确地编辑标准品选Standard类型、阴性参照选Negative Control类型、阳性参照选Positive Control类型、未知样本选Unknown类型，此外标准品系确定浓度的阳性样本，其设定为Standard类型后还需在Concentration一栏中对各标准品分别设定其相应的浓度，以及在Abs Quant/Units填写框中填写相应的浓度单位，如copies、pg等。 在Target Name一栏中可以填写该检测试验所要检测的指标，如乙肝病毒、禽流感病毒、沙门氏菌等。 如在试验中须要设置重复样本的，可在Repl Of一栏中填写该样本其所重复的样本的座标号留意，只能填写座标号，不能填写样本名。 如进展的是多色荧光PCR检测试验，那么在Select Filter Combinations一栏中选定各检测通道，分别进展样本编辑。 在进展定性检测试验时，参加试验的样本有阴性参照、阳性参照、未知样本。设置相应较简洁，可参考以下设置六运行试验试验程序和样本均设置完毕后，即可运行试验，详细操作：进入“New Experiment”界面，点击左侧按钮，如反响板已经放入仪器，仪器主机正面右侧的LED灯会由桔黄色变为绿色，软件界面右下边的这时点击“Start Run”按钮，软件界面跳出一对话框提示用户给该试验文件命名，以保存试验结果。一般建立用户以时间命名，以便利日后查找试验结果，如20080816-HBV-1，20080817-AIV-2等。命名后点击确认键，仪器就起先运行了，在运行过程中可视察到温度和荧光信号的改变曲线。如进展多重荧光PCR试验，可在荧光历史“Fluorescence History”界面内上的下拉菜单中切换不同的检测通道，以分别视察其扩增状况。 在试验运行过程中，用户可以依据须要，点击“10 Cycles”按钮增加正在运行的程序10个循环，也可以点击“End Program”按钮终止正在运行的子程序，干脆进入下一个子程序。七数据分析定性和定量试验运行完毕后，点击界面左侧的按钮分析数据。或者翻开LightCycler480软件，胜利登录后点击右侧图标，进入Navigator导航界面，在书目树内选定之前已完成的试验文件，点击下方“Open”按钮，或双击文件名翻开试验文件，点击左侧按钮，进入分析界面。在“Create new analysis”窗口内显示了可运用的分析方法，在“Open existing analysis”窗口内显示已经进展分析的结果内容。要进展定性和定量分析可以选择Abs Quant分析功能，其有两种分析模式，2nd Derivative Max二阶最大求导法和Fit Points点拟合法。选定分析功能类型后会跳出对话框，用户可以自行选择分析类型、选择要分析的亚组Subset，以及命名分析结果Name。点击“”按钮确认。在Analysis界面中选择Abs Quant2nd Derivative Max，点击“Calculate”按钮，生成Cp值，照试验中有标准品，那么同时生成标准曲线，并且计算出各未知样本的浓度值。该方法在反响体系优化得比拟成熟，信号噪音比拟低时运用较好。有时从原始荧光曲线能视察到有个别样本的曲线不正常，信号噪音比拟高，那么可选用Fit Points点拟合法加以人工调整。详细操作如下：在Analysis界面中选择Abs QuantFit Points，在“Cycle Range”中First Cycle和Last Cycle两栏分别设置分析数据的起始和终止循环数。选定详细数据后，软件只分析该区间内的试验曲线。“Background”一栏设置荧光信号本底的区域，一般将荧光值呈S形曲线增长前趋于水平的循环区域作为背景本底区。点击“Noise Band”按钮，上下移动红色的噪音本底线来消退个别样本由于信号噪音较高而对结果造成的影响。一般将红线置于尽可能低，但又要足以盖过阴性线和曲线不平的噪音线，与荧光信号曲线交于线性增长区。软件只分析红色噪音本底线上方的曲线数据，所以要确保其上方无曲折不平的噪音信号。点击“Analysis”按钮，再点击“Threshold”按钮，运用显示“Auto”字样，然后点击下方按钮，生成各样本的CP值。假设是定量分析，那么会生成各标准曲线，以及各样本的浓度值。点击软件右侧的图标，将分析结果保存入试验文件，或在书目树中另找保存位置。 在进展多色荧光PCR试验时，同时运用相邻两个检测通道进展检测须要通过颜色补偿功能来校正相邻通道的荧光信号干扰，详见颜色补偿一章。八报告生成 翻开一个分析完结果的文件，或者刚分析完结果并贮存后，点击左侧工具栏中按钮，进入结果报告的界面。可在“General”和“Detailed”两栏中选择试验报告所要包含的内容。“General”一栏中显示的选项为本次试验结果均须要显示的报告参数；“Detailed”一栏那么显示本次试验屡次分析中所要的报告参数的明细。点击“Generate”按钮，生成报告预览。点击右上方“PDF”按钮可将报告保存为*.pdf文件。 报告显示所包括的内容可以保存成模板文件，同类报告要求的试验可以调用一样的报告模板。在“General”和“Detailed”两栏中选定了内容后点击下方按钮右侧的下拉箭头，点击“Save As Template”将其保存至Templates/Report Templates书目下，点击“”按钮确认。调用报告模板时点击“Apply Template”按钮，选定模板文件，点击“”按钮确认。九数据导出与导入该软件所产生的试验数据均保存在其自带的数据库中，从Windows操作系统中无法找到其试验数据的文件。这样可以很好地爱护试验文件不被误删和窃取。如用户盼望将试验结果备份保存，可以将数据从数据库中导诞生成可见的文件，保存于其它电脑中或本电脑的其它书目下。同时，也可以将试验文件导入数据库查看文件内容或对文件进展分析。导出单个试验文件的方法：翻开LightCycler480软件，胜利登录后点击右侧图标，进入Navigator导航界面，在书目树内选定试验文件，点击下方按钮，选择保存文件的书目位置，点击“Save”按钮将文件导出。 导出整个文件夹中全部文件的方法：翻开LightCycler480软件，胜利登录后点击右侧图标，进入Navigator导航界面，在书目树内选定要导出文件所在的文件夹，点击按钮，在“Select Folders”一栏中选定保存预导出文件的书目，点击按钮，将所要导出的文件书目均选至右侧对话框，点击进入“Target”界面，点击“Browse”按钮选定导出的文件所要存放的书目，点击“Next”按钮进入“Options”界面，去除不须要导出的文件前的“”，用户也可设定导出文件的限制。点击“Next”按钮，进入“Start”界面，点击“Next”按钮，软件显示文件导出的过程和状态，完成后进入“Done”界面，显示导出文件的报告。点击“Done”按钮确认。 导入单个文件的方法：翻开LightCycler480软件，胜利登录后点击右侧图标，进入Navigator导航界面，在书目树内选定试验文件，点击下方“Import”按钮，选定所要导入的文件，点击“Open”按钮，即导入该文件。 导入整个文件夹中全部文件的方法：翻开LightCycler480软件，胜利登录后点击右侧图标，进入Navigator导航界面，在书目树内选定试验文件，点击下方“Batch Import”按钮，进入“Source”界面，点击“Add”按钮选定待导入的文件所在的文件夹，点击“Next”按钮，进入“Target”界面，选定放置导入文件的文件夹，点击“Next”按钮进入“Start”界面，点击“Next”按钮，进入“Status”界面，起先导入文件，最终进入“Done”界面，生成导入文件报告，点击“Done”确认。十单点定标 同一种同一批号的试剂盒以一样的反响程序进展多轮定量检测试验时，无须每次都做四至五个标准品来作标准曲线。第一轮检测试验胜利完成后，可以将该试验产生的标准曲线保存下来，下一轮检测试验时，只需选与第一轮试验对应的一种浓度的标准品参加试验即可。在分析数据时可以调用第一轮的标准曲线进展定量。 标准曲线的保存：运用四至五个标准品以及多个未知样本进展检测试验后，分析数据，最终得到数据结果后，点击标准曲线下方“Std Curve (In run) ”右侧下拉前头，选中 “Save as external”选项。命名标准曲线，并将其保存于Special DataStd Curve文件夹下，点击“”按钮确认。 已有标准曲线的调用：在运用单点定标的检测试验中，所选用的一个标准品仍旧定义为“Standard”类型，并且其浓度在已有的标准曲线浓度范围之内。在分析数据时，一起先无标准曲线生成，点击“Standard Curve(In Run)”按钮右侧下拉箭头，选中“Std Curve(external)”选项，双击所要调用的标准曲线文件，点击“Calculate”按钮，即可调用从前试验中的标准曲线进展本次试验的定量分析。 留意：保存标准曲线文件时所采纳的分析模式必需与调用标准曲线时的分析模式一样才能胜利调用标准曲线。十一相对定量试验设计和分析 进展相对定量试验时要留意，一般而言，每个样本均做三个重复，以得到标准误的数据，进展相对定量试验时样本编辑最关键，样本编辑正确了，分析数据完全可以一键完成。1、 相像相对定量 所谓相像相对定量是指默认看家基因和靶基因这两对引物的PCR扩增效率均为2.00时进展的相对定量的算法，其主要是以Cp值的差值来推算浓度的差异。PCR手册规定，靶基因和看家基因这两对引物的PCR扩增效率差异不超过0.1的状况下，可进展相像相对定量计算，看一下某基因mRNA水平表达量改变的趋势，假如其扩增效率差异超过0.1，那么不能运用相像相对定量算法否那么在许多期刊发文章时会被要求补试验或重新做定量试验。出现这种状况时，方法一：重新设计引物，优化反响体系，使扩增效率差异小于0.1；方法二：采纳精确相对定量算法，见下第2。 进展相像相对定量时，可同时设定多个靶基因跟同一个看家基因进展比拟。如下列图：三个样本，分别用一个看家基因Reference Gene，两个不同靶基因Target A 和Target B进展相对定量。在建立了含有全部本次试验中检测样本孔位的Subset后，点击按钮，在Rel Quant相对定量界面内设置样本信息。 在Repl of 一栏中填写其所要重复试验的样本的座标号，如在A2和A3位进展A1位样本的两次重复试验，那么在A2和A3位的Repl of 一栏填写A1即可。 在Sample Name一栏填写样本名，留意，只要是加同一模板的反响孔位，均给其命名为一样的样本名。例如A1、B1、C1孔位，虽然是用不同的引物分别扩增不同的基因，但所加的样本模板是一样的，所以在Sample Name一栏中填写一样的样本名，可以用键盘“Ctrl+C”复制Reference Gene的样本名，然后用键盘“Ctrl+V”粘贴至Target Gene A和Target Gene B的样本名中，以确保所命名一样。另外，必须要设置阴性参照试验组，即其它反响体系均不变，只是不加PCR模板的质控，一般命名为NC或NTCNo Template Control 在Sample Type一栏中分别选择各样本的不同类型。看家基因的检测孔位均选择带有Reference的类型，靶基因的检测孔位均选择带有Target的类型，如上图。其中将Sample1的类型选为Calibrator即标准样本，在相对定量计算时，其它样本均与该标准样本进展比拟，以得到基因表达量更多或更少的数据。一般可以将试验中的空白参照样本选为标准样本，例如用不同的药物A、B、C处理一批细胞，其它有一批细胞是正常造就，没有处理的，那么没有用药物处理的细胞可设为标准样本Calibrator，其它用药组样本均与该样本进展比拟。而这些处理组的样本类型均可以选定为Unkown，检测看家基因的孔位类型选为Reference Unknown，检测靶基因的孔位类型选为Target Unknown。阴性参照样本可依据其所用引物的不同选定类型为Reference Negative和Target Negative。 在Target Name一栏中填写检测的基因名，如以B-actin作为看家基因的话，在全部看家基因样本的Target Name一栏均填写B-actin；而靶基因以此类推，如上图。 Efficiency默认为2.00。将以上样本编辑完成后，设置PCR反响程序，即可运行仪器，进展试验。 试验完毕后，可点击左侧的按钮，进入分析界面，选择Relative Quantification分析数据，点击按钮即可生成相对定量的数据。 留意，假如阴性参照Negative样本产生了扩增曲线，软件会判定该试验失败，采纳SYBR Green I进展试验时，由于不行幸免地产生一些非特异扩增和引物二聚表达象，往往会导致软件无法计算出结果，这个时候可以将阴性参照样本的类型改为Target Unknown或Reference Unkown来看一下试验的分析结果。但出现阴性参照样本产生阳性扩增曲线的现象时，必须要进展Tm Calling分析，看一下熔解曲线峰，以进一步分析所造成的缘由。假如其熔解曲线与PCR目标扩增产物峰的Tm值一样，即试剂被阳性PCR扩增片段污染，所得定量结果不精确，要解决该污染问题后重新进展试验；假如阴性样本的熔解曲线峰与PCR目标扩增产物峰的Tm值不一样，那么有可能是引物二聚体或非特异扩增产物的缘由，其同样影响定量结果，要想方法优化试验解除其影响。 另外，假如Calibrator标准样本的看家基因和靶基因无扩增的话，也会导致软件无法计算出结果。2、精确相对定量 所谓精确相对定量是指采纳PCR扩增效率校正的相对定量算法，其将看家基因和靶基因的PCR扩增效率的详细值计算出来后参加至定量计算中去，因而其结果更能够表达实际的状况。 其设置大致与相像相对定量一样，只是样本类型处多了标准品，如下：样本检测中增加了STD1、STD2、STD3、STD4四个“标准品”，其在看家基因检测中的样本类型为Ref Standard，在靶基因检测中的样本类型为Target Standard，在Concentration一栏中分别填写这些“标准品”的浓度这些浓度不是精确的浓度，这些标准品的浓度也是未知的，可以仍选一个样本，进展十倍梯度稀释，分别用看家基因和靶基因的引物对这些稀释产生的模板进展扩增，而对这些在 Concentration中填写的浓度只要表达出这些样本的十倍浓度差即可，即1、10、100、1000或1、0.1、0.01、0.001等。软件可以通过这些“标准品”作出标准曲线，计算得到相应引物的PCR扩增效率。 试验完毕后同样点击软件界面左侧的按钮，进入分析界面，选择Relative Quantification分析数据，点击按钮即可生成相对定量的数据。 留意，所选用的“标准品”如有几个低浓度的无扩增，会影响标准曲线的生成，导致软件无法生成数据，因而尽可能选用起始浓度较高样本进展梯度稀释。 也可以在进展相像相对定量试验以后，选用起始浓度最高的样本进展梯度稀释，计算出PCR的扩增效率，然后将该标准曲线保存在标准曲线下方点击“Std Curve (In run)”右侧的下拉箭头选择Save as external即可保存，翻开前一轮相像相对定量的试验结果，在分析界面中点击 “Std Curve (In run)”图标右侧的下拉箭头，选择“Std Curve (External)”调用已保存的标准曲线，以使得各引物的扩增效率参加相对定量计算。这样可幸免重复试验。