沉淀分离法复习课程

沉淀分离法第四章第四章沉淀分离法沉淀分离法 沉淀法沉淀法：利用某种沉淀剂或改变条件，使所需提取利用某种沉淀剂或改变条件，使所需提取的物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成的物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。无定形固体沉淀的过程。具有浓缩和分离的双重作用。具有浓缩和分离的双重作用。在蛋白质、酶、多肽、核酸和其他细胞组在蛋白质、酶、多肽、核酸和其他细胞组分的回收和分离中应用的很多。分的回收和分离中应用的很多。盐析沉淀法盐析沉淀法有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀等电点沉淀法等电点沉淀法成盐沉淀法成盐沉淀法高分子聚合物沉淀高分子聚合物沉淀选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法 一、盐析沉淀法一、盐析沉淀法 盐析法盐析法：在在高浓度高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性中性盐存在下，欲分离物质在中性盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。早在早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白质（酶）等生物大分子物质。质（酶）等生物大分子物质。（一）基本原理（一）基本原理 蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。这些性质就本质而言是水分子间的这些性质就本质而言是水分子间的氢键氢键和蛋白和蛋白质表面所暴露出的质表面所暴露出的N、O原子的相互作用原子的相互作用，所以，所以易受溶液温度、易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等值、介电常数和离子强度等参数的影响。参数的影响。蛋白质在自然环境中通常是蛋白质在自然环境中通常是可溶可溶的，的，表面：大部分是亲水基团表面：大部分是亲水基团 内部：大部分是疏水基团内部：大部分是疏水基团蛋白质呈稳定蛋白质呈稳定的分散状态的分散状态两性物质，一定两性物质，一定pHpH下表面带有一定的下表面带有一定的电荷，电荷，静电斥力作用静电斥力作用使分子间相互排斥使分子间相互排斥蛋白质周围的水分子有序排列，在表面蛋白质周围的水分子有序排列，在表面形成形成水化膜水化膜，这一层能保护蛋白质粒子，这一层能保护蛋白质粒子避免因碰撞而聚沉。避免因碰撞而聚沉。当向蛋白质溶液中加入当向蛋白质溶液中加入中性盐中性盐时：时：低盐低盐-盐溶盐溶(低盐情况下，随着中性盐离子强度的低盐情况下，随着中性盐离子强度的增加，蛋白质溶解度增大增加，蛋白质溶解度增大)高盐高盐-盐析盐析(高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小)盐离子部分中和蛋白盐离子部分中和蛋白质的电性，使分子间质的电性，使分子间排斥作用减弱排斥作用减弱中性盐的亲水性比蛋白质大，中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化作用盐离子在水中发生水化作用从而使从而使蛋白质脱去水化膜蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区域暴露出疏水区域H+OH-+pHpI,pHpI,pHpI,带负电，带负电，有水膜，是稳定有水膜，是稳定的亲水胶体的亲水胶体_+_pH=pIpH=pI时时,有水膜，有水膜，是不稳定的亲水是不稳定的亲水胶体胶体中性盐中性盐破坏水膜破坏水膜+中性盐中性盐破坏水膜破坏水膜_+_中性盐中性盐破坏水膜破坏水膜_中性盐中性盐中和电荷中和电荷SOSO4 42-2-中性盐中性盐中和电荷中和电荷NHNH4 4+或或NaNa+蛋白质的盐析机制示意图蛋白质的盐析机制示意图蛋白质沉淀蛋白质沉淀 蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度有关，还与度有关，还与离子所带电荷数离子所带电荷数有关，高价离子影有关，高价离子影响更显著。响更显著。通常用通常用离子强度离子强度表示对盐析的影响。表示对盐析的影响。1 2 3 4 5 61.02.52.00.5-0.5-1.0-1.5 01.5碳氧血红蛋白的碳氧血红蛋白的lgS与与(NH4)2SO4离子强离子强度度的关系的关系S0(离子强度离子强度)lgS盐析盐析盐溶盐溶盐析区盐析区:lgS=-Ks 蛋白质溶解度蛋白质溶解度常数常数盐析常数盐析常数 盐离子强度盐离子强度蛋白质溶解度蛋白质溶解度起始蛋白起始蛋白浓度浓度 （二）无机盐的选择（二）无机盐的选择 在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有(NH(NH4 4)2 2SO4,SO4,Na2SO4，MgSO4，NaH2PO4，NaCl，Na3PO4,K3PO4。(NH4)2SO4原因原因廉价廉价在水中溶解度大，且溶解度随温度变在水中溶解度大，且溶解度随温度变化小，低温下仍具有较大的溶解度化小，低温下仍具有较大的溶解度对大多数蛋白质的活力无损害对大多数蛋白质的活力无损害0 20 40 60 80 100中性盐中性盐温度（温度（oC）(NH4)2SO4Na2SO4MgSO4NaH2PO470.6 75.4 81.0 88.0 95.3 1034.9 18.9 48.3 45.3 43.3 42.2-34.5 44.4 54.6 63.6 70.81.6 7.8 54.1 82.6 93.8 101 常用盐析剂在水中的溶解度（常用盐析剂在水中的溶解度（g/100ml水）水）盐析效果：阴离子盐析效果：阴离子 阳离子阳离子尤其以尤其以高价阴离子高价阴离子更为明显。更为明显。常见阴离子常见阴离子的盐析作用顺序：的盐析作用顺序：PO43-SO42-CH3COO Cl NO3 ClO4 I SCN阳离子阳离子对盐析效果的影响：对盐析效果的影响：Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+无机盐可按两种方式加入溶液中：无机盐可按两种方式加入溶液中：直接加入固体直接加入固体(NH(NH4 4)2 2SO4SO4粉末粉末工业生产工业生产 (分批加入，充分搅拌分批加入，充分搅拌)加入加入(NH(NH4 4)2 2SO4SO4饱和溶液饱和溶液实验室和小规模生产实验室和小规模生产 (防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释)（三）影响盐析的各种因素（三）影响盐析的各种因素 无机盐的加入量无机盐的加入量蛋白质的浓度蛋白质的浓度温度温度pHpH操作方式操作方式1.1.无机盐加入量的影响无机盐加入量的影响1 2 3 4 5 61.02.52.00.5-0.5-1.0-1.5 01.5S0(离子强度离子强度)lgS盐析盐析蛋白质溶解度蛋白质溶解度0 2 4 6 8 10-0.500.50-1.00(离子强度离子强度)lgS蛋白质溶解度蛋白质溶解度 0不同蛋白质溶解度与离子强度的关系不同蛋白质溶解度与离子强度的关系蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同 对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即具有一淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即具有一定的蛋白质盐析分布曲线。定的蛋白质盐析分布曲线。30lgS蛋白质溶解度蛋白质溶解度20 30 40 50 60 702040100P不同不同(NH4)2SO4 饱和度饱和度C0蛋白质沉淀的速度可用蛋白质沉淀的速度可用 -对盐饱和度（对盐饱和度（P P）作图来表示：作图来表示：dSdP 620 30 40 50 60 704820dSdP 蛋白质溶解度随蛋白质溶解度随(NH4)2SO4 饱和度而变化的速率饱和度而变化的速率P利用不同利用不同蛋白质盐析分布蛋白质盐析分布曲线曲线在横轴上的位置不同，在横轴上的位置不同，可采取可采取先后加入不同量无先后加入不同量无机盐机盐的办法来分级沉淀蛋的办法来分级沉淀蛋白质。白质。2.2.蛋白质浓度的影响蛋白质浓度的影响 蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。随浓度提高，盐用量减少随浓度提高，盐用量减少。640 50 60 70 804820dSdP P不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线3g/L30g/L分级沉淀分级沉淀：将溶液稀释，使重将溶液稀释，使重叠曲线拉开距离叠曲线拉开距离制取成品制取成品：提高蛋白质浓度提高蛋白质浓度3.3.温度的影响温度的影响低盐浓度：温度升高，溶解度升高低盐浓度：温度升高，溶解度升高高盐浓度：温度升高，溶解度降低高盐浓度：温度升高，溶解度降低 温度适当提高有利于蛋白质沉淀。温度适当提高有利于蛋白质沉淀。高温容易导致蛋白质变性。高温容易导致蛋白质变性。蛋白质盐析一般在蛋白质盐析一般在室温室温下进行，某些温下进行，某些温度敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。度敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。4.pH 4.pH的影响的影响 蛋白质在蛋白质在pIpI时的溶解度最小，最容易从时的溶解度最小，最容易从溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质的的pIpI附近。附近。耗盐少，蛋白质收率也高耗盐少，蛋白质收率也高 5.5.操作方式的影响操作方式的影响 10 50 60 70 饱和度（饱和度（%）52.51 酶活性酶活性 U/ml操作方式对延胡索酸酶盐析的影响操作方式对延胡索酸酶盐析的影响固体，固体，间歇间歇12h12h饱和溶液，饱和溶液，间歇间歇12h12h饱和溶液，饱和溶液，连续连续12h饱和溶液，饱和溶液，连续连续1.6min采用间歇方式所需盐量比连续方式少；采用间歇方式所需盐量比连续方式少；间歇操作中，用饱和溶液的需盐量比用固体盐的高。间歇操作中，用饱和溶液的需盐量比用固体盐的高。6.6.盐析法的优缺点盐析法的优缺点（1 1）优点：）优点：室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失活；活；非蛋白的杂质很少被夹带沉淀；非蛋白的杂质很少被夹带沉淀；适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用 设备简单，操作方便。设备简单，操作方便。（2 2）缺点：）缺点：沉淀物中含有大量盐析剂沉淀物中含有大量盐析剂 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能直接用于医药上直接用于医药上 盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。二、有机溶剂沉淀法二、有机溶剂沉淀法 在蛋白质等生物大分子的水溶液中加入一定量在蛋白质等生物大分子的水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，能显著降低蛋白质等生物大亲水性的有机溶剂，能显著降低蛋白质等生物大分子的溶解度，使其沉淀析出。分子的溶解度，使其沉淀析出。不同蛋白质沉淀时所需有机溶剂的浓度不同，不同蛋白质沉淀时所需有机溶剂的浓度不同，因此调节有机溶剂的浓度，可以使混合物中的蛋因此调节有机溶剂的浓度，可以使混合物中的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。白质分段析出，达到分离纯化的目的。不仅适于蛋白质的分离纯化，还常用于酶、核不仅适于蛋白质的分离纯化，还常用于酶、核酸、多糖等的分离纯化。酸、多糖等的分离纯化。（一）基本原理（一）基本原理 加入有机溶剂后，会使系统（水和有机溶剂的加入有机溶剂后，会使系统（水和有机溶剂的混合液）的混合液）的介电常数减小介电常数减小，而使溶质分子（如，而使溶质分子（如蛋白质分子）之间的蛋白质分子）之间的静电引力增加静电引力增加，从而促使，从而促使它们互相聚集，并沉淀出来。它们互相聚集，并沉淀出来。水溶性有机溶剂的亲水性强，它会抢夺本来与水溶性有机溶剂的亲水性强，它会抢夺本来与溶质结合的自由水，使其表面的溶质结合的自由水，使其表面的水化层破坏水化层破坏，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生凝聚，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生凝聚，沉淀析出。沉淀析出。常用于生物大分子沉淀的有机溶剂：常用于生物大分子沉淀的有机溶剂：甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等，甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等，其中其中乙醇乙醇是工业上最常用的是工业上最常用的 （二）影响沉淀效果的因素（二）影响沉淀效果的因素 温度温度pHpH中性盐浓度中性盐浓度金属离子金属离子1.1.温度的影响温度的影响 有机溶剂存在下，有机溶剂存在下，多数蛋白质的溶解度随温度多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著的减小降低而显著的减小，因此低温下（最好低于，因此低温下（最好低于0 0o oC C）沉淀得完全，有机溶剂用量可减少。沉淀得完全，有机溶剂用量可减少。实际操作中：实际操作中：有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加对溶液的温度显著升高，从而增加对蛋白质的变性蛋白质的变性作用。作用。整个操作过程应在整个操作过程应在低温低温下进行。下进行。具体操作时：具体操作时：将待分离溶液和有机溶剂分别进行将待分离溶液和有机溶剂分别进行预冷预冷：蛋白质溶液冷却到蛋白质溶液冷却到0 0o oC C左右，左右，有机溶剂预冷到有机溶剂预冷到-10-10o oC C以下以下 为避免温度骤然升高损失蛋白质活力，操作为避免温度骤然升高损失蛋白质活力，操作时应不断时应不断搅拌搅拌、少量多次加入少量多次加入。使沉淀在低温下短时间处理后即进行过滤或使沉淀在低温下短时间处理后即进行过滤或离心分离，接着真空抽去剩余溶液或将沉淀溶入离心分离，接着真空抽去剩余溶液或将沉淀溶入大量缓冲溶液中以稀释有机溶剂，旨在大量缓冲溶液中以稀释有机溶剂，旨在减少有机减少有机溶剂与目的物的接触溶剂与目的物的接触。温度的控制应根据蛋白质的稳定性而不同，稳温度的控制应根据蛋白质的稳定性而不同，稳定性较差的物质，冷却至低温是必要的；但对于定性较差的物质，冷却至低温是必要的；但对于稳定性较好的物质，如淀粉酶，温度不需过低，稳定性较好的物质，如淀粉酶，温度不需过低，10-1510-15o oC C。2.pH2.pH的影响的影响 在等电点时蛋白质溶解度最低，因此有机溶剂在等电点时蛋白质溶解度最低，因此有机溶剂沉淀时溶液沉淀时溶液pHpH多控制在蛋白质多控制在蛋白质等电点附近等电点附近。pHpH的控制必须的控制必须考虑蛋白质的稳定性考虑蛋白质的稳定性：某些酶的等电点在某些酶的等电点在pH4-5pH4-5之间，比其稳定的之间，比其稳定的pHpH范范围低，因此围低，因此pHpH应首先满足蛋白质稳定性的条件。应首先满足蛋白质稳定性的条件。控制控制pHpH时应使大多数蛋白质分子时应使大多数蛋白质分子带相同电荷带相同电荷，不要让目的物与主要杂质分子带相反电荷，以免不要让目的物与主要杂质分子带相反电荷，以免共沉。共沉。3.3.无机盐的离子强度无机盐的离子强度 少量的中性盐少量的中性盐能够减少蛋白质变性。在有机溶能够减少蛋白质变性。在有机溶剂沉淀时中性盐浓度以剂沉淀时中性盐浓度以0.01-0.05 mol/L为宜。为宜。常用中性盐常用中性盐:乙酸钠、乙酸铵、氯化钠乙酸钠、乙酸铵、氯化钠 中性盐浓度较高时（中性盐浓度较高时（0.2 mol/L以上以上），由于盐），由于盐溶作用会增大蛋白质的溶解度，此时需增加有机溶作用会增大蛋白质的溶解度，此时需增加有机溶剂的用量才能使沉淀析出。溶剂的用量才能使沉淀析出。对盐析后的上清液或沉淀物，如进一步用有机对盐析后的上清液或沉淀物，如进一步用有机溶剂沉淀法纯化，必须先脱盐。溶剂沉淀法纯化，必须先脱盐。4.4.金属离子金属离子 一些一些金属离子金属离子，如，如CaCa2+2+、ZnZn2+2+能与蛋白质结合能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度大大降低而不影形成复合物，使蛋白质溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并减少有机溶响生物活性，有利于沉淀形成，并减少有机溶剂用量。剂用量。使用时避免能与这些金属离子形成难溶盐的使用时避免能与这些金属离子形成难溶盐的阴离子存在（如磷酸根）。阴离子存在（如磷酸根）。常用的锌盐：醋酸锌或硫酸锌常用的锌盐：醋酸锌或硫酸锌5.5.有机溶剂沉淀法的优缺点有机溶剂沉淀法的优缺点（1 1）优点：）优点：乙醇等有机溶剂易挥发除去，不会残留于成乙醇等有机溶剂易挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净（不需要脱盐处理）；品中，产品更纯净（不需要脱盐处理）；有机溶剂密度低，沉淀物与母液间的密度差有机溶剂密度低，沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易，适于用离心分离收集沉淀物。较大，分离容易，适于用离心分离收集沉淀物。（2 2）缺点：）缺点：容易使蛋白质变性容易使蛋白质变性，操作需要在低温下进行，操作需要在低温下进行，使用上有一定的局限；使用上有一定的局限；采用大量有机溶剂，采用大量有机溶剂，成本较高成本较高。为节省用量，通常将蛋白质溶液适当浓缩，并回为节省用量，通常将蛋白质溶液适当浓缩，并回收溶剂。收溶剂。有机溶剂有机溶剂易燃易爆易燃易爆，工业生产上车间和设备，工业生产上车间和设备都应有防护措施。都应有防护措施。等电点沉淀法等电点沉淀法成盐沉淀法成盐沉淀法高分子聚合物沉淀高分子聚合物沉淀选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法 三、其他沉淀方法三、其他沉淀方法 1.1.等电点沉淀法等电点沉淀法 两性物质在两性物质在pH=pIpH=pI时，分子表面净电荷为零，分时，分子表面净电荷为零，分子间静电排斥作用减弱，因此吸引力增大，能相子间静电排斥作用减弱，因此吸引力增大，能相互聚集，发生沉淀。互聚集，发生沉淀。不同的两性物质，不同的两性物质，pIpI不同，如不同蛋白质。根不同，如不同蛋白质。根据这一特性，用据这一特性，用依次改变溶液依次改变溶液pHpH的方法可将不同的方法可将不同的蛋白质分别沉淀析出的蛋白质分别沉淀析出，达到分离纯化的目的。，达到分离纯化的目的。只适用于水化程度不大、在只适用于水化程度不大、在pIpI时溶解度很低时溶解度很低的的两性物质，如酪蛋白。两性物质，如酪蛋白。对于亲水性很强的两性物质对于亲水性很强的两性物质，在，在pIpI及及pIpI附近仍附近仍有相当的溶解度，用该法沉淀不完全，而且许多有相当的溶解度，用该法沉淀不完全，而且许多生物分子的生物分子的pIpI很接近，因此很少单独使用。很接近，因此很少单独使用。往往与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方往往与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法结合起来。法结合起来。采用该法时采用该法时必须注意：必须注意：溶液溶液pHpH不会影响到目的物质的稳定性不会影响到目的物质的稳定性。等电点沉淀法可用于所需物质的提取，也可用等电点沉淀法可用于所需物质的提取，也可用于沉淀于沉淀除去杂蛋白及其他杂质除去杂蛋白及其他杂质，实际工作中普遍，实际工作中普遍采用该方法作为采用该方法作为去杂手段去杂手段。如在工业上生产胰岛素时：如在工业上生产胰岛素时：先调先调pHpH至至8.08.0去除碱性杂蛋白，再调去除碱性杂蛋白，再调pHpH至至3.03.0去去除酸性杂蛋白。粗酶液经过这样的处理后纯度大除酸性杂蛋白。粗酶液经过这样的处理后纯度大大提高，有利于后面的操作。大提高，有利于后面的操作。2.2.成盐沉淀法成盐沉淀法 某些生化物质（如核酸、蛋白质、多肽、氨基某些生化物质（如核酸、蛋白质、多肽、氨基酸、抗生素等）能和重金属、某些有机酸及无机酸、抗生素等）能和重金属、某些有机酸及无机酸形成难溶性的盐类复合物而沉淀。酸形成难溶性的盐类复合物而沉淀。金属离子沉淀法金属离子沉淀法有机酸沉淀法有机酸沉淀法无机酸沉淀法无机酸沉淀法注意注意：形成复合盐后，常使蛋白质发生不可逆：形成复合盐后，常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用时必须谨慎。的沉淀，应用时必须谨慎。（1 1）金属离子沉淀法）金属离子沉淀法 许多有机物（包括蛋白质）在碱性溶液中带负许多有机物（包括蛋白质）在碱性溶液中带负电荷，因此能与金属离子形成金属复合盐沉淀。电荷，因此能与金属离子形成金属复合盐沉淀。根据与有机物作用的机制不同，可将金属离根据与有机物作用的机制不同，可将金属离子分为三类：子分为三类：能与能与羧基、含氮化合物和含氮杂环化合物羧基、含氮化合物和含氮杂环化合物结合，结合，如如Mn2+,Fe2+,Co2+,Ni2+,Cu2+,Zn2+等等 能与能与羧基羧基结合，但不能与含氮化合物结合，结合，但不能与含氮化合物结合，如如Ca2+,Ba2+,Mg2+,Pb2+等等 能与能与巯基巯基结合，如结合，如Hg2+,Ag+,Pb2+等等 分离出沉淀物后，如何去除金属离子？分离出沉淀物后，如何去除金属离子？可用可用H H2 2S S使金属变成硫化物而除去，也可采用使金属变成硫化物而除去，也可采用离离子交换法子交换法或或金属螯合剂金属螯合剂EDTAEDTA等将金属离子除去。等将金属离子除去。金属离子沉淀法除提取生化物质外，金属离子沉淀法除提取生化物质外，还能用于还能用于沉淀去除杂质沉淀去除杂质：如锰盐能选择性的沉淀发酵液中的核酸，降低如锰盐能选择性的沉淀发酵液中的核酸，降低发酵液黏度，以利于后续操作；发酵液黏度，以利于后续操作；ZnSOZnSO4 4能沉淀红霉能沉淀红霉素发酵液中的杂蛋白以提高过滤速度。素发酵液中的杂蛋白以提高过滤速度。（2 2）有机酸沉淀法）有机酸沉淀法 （有机酸：具有酸性的有机化合物）（有机酸：具有酸性的有机化合物）某些有机酸如某些有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸和三氯乙苦味酸、苦酮酸、鞣酸和三氯乙酸酸等，能与有机分子的碱性功能团形成复合物而等，能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。沉淀析出。这些有机酸与蛋白质形成盐复合物沉淀时，常这些有机酸与蛋白质形成盐复合物沉淀时，常发生不可逆的沉淀反应，所以用此法制备蛋白质发生不可逆的沉淀反应，所以用此法制备蛋白质和酶时，需采用和酶时，需采用较温和的条件较温和的条件，有时还加入一定，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。的稳定剂，以防止蛋白质变性。鞣酸（单宁）鞣酸（单宁）多元酚类化合物多元酚类化合物 分子上有羧基和多个羟基，分子上有羧基和多个羟基，蛋白质分子中有氨基、亚氨基和羧基，所以可蛋白质分子中有氨基、亚氨基和羧基，所以可与单宁分子形成为数众多的与单宁分子形成为数众多的氢键氢键而结合在一起，而结合在一起，生成巨大的复合颗粒而沉淀下来。生成巨大的复合颗粒而沉淀下来。如何使蛋白质游离释放出来？如何使蛋白质游离释放出来？单宁与蛋白质的结合比较牢固，不易分开，多单宁与蛋白质的结合比较牢固，不易分开，多采用采用竞争结合法竞争结合法：用比蛋白质更强的结合剂与单：用比蛋白质更强的结合剂与单宁结合，竞争性结合剂有宁结合，竞争性结合剂有PVPPVP（与单宁形成氢键的（与单宁形成氢键的能力很强），聚乙二醇、聚氧化乙烯、山梨糖醇能力很强），聚乙二醇、聚氧化乙烯、山梨糖醇甘油酸酯甘油酸酯 三氯乙酸（三氯乙酸（TCATCA）沉淀蛋白质迅速且完全，一般会引起变性。沉淀蛋白质迅速且完全，一般会引起变性。低温下短时间作用可使某些较稳定的蛋白质或低温下短时间作用可使某些较稳定的蛋白质或酶保持原有活力，多用于目的物较稳定且分离杂酶保持原有活力，多用于目的物较稳定且分离杂蛋白相对困难的场合。蛋白相对困难的场合。雷凡诺雷凡诺吖啶染料吖啶染料 沉淀机制比一般有机酸盐复杂，但与蛋白质作沉淀机制比一般有机酸盐复杂，但与蛋白质作用也主要是通过形成盐的复合物而沉淀的。用也主要是通过形成盐的复合物而沉淀的。提纯血浆中提纯血浆中-球蛋白有较好效果。球蛋白有较好效果。（3 3）无机酸沉淀法）无机酸沉淀法 （无机酸：能解离出氢离子的无机化合物，如硫酸、盐（无机酸：能解离出氢离子的无机化合物，如硫酸、盐酸、硝酸、次氯酸等；酸、硝酸、次氯酸等；有机酸：具有酸性的有机化合物，最常见是羧酸）有机酸：具有酸性的有机化合物，最常见是羧酸）某些无机酸如某些无机酸如磷钨酸、磷钼酸磷钨酸、磷钼酸等能与阳离子形等能与阳离子形式的蛋白质形成溶解度极低的复合盐，使蛋白质式的蛋白质形成溶解度极低的复合盐，使蛋白质沉淀析出。沉淀析出。无机酸如何去除？无机酸如何去除？得到沉淀物后，可在沉淀物中加入无机酸并用得到沉淀物后，可在沉淀物中加入无机酸并用乙醚乙醚萃取萃取，把磷钨酸、磷钼酸等移入乙醚中除去；，把磷钨酸、磷钼酸等移入乙醚中除去；或用或用离子交换法离子交换法除去。除去。3.3.高分子聚合物沉淀高分子聚合物沉淀 某些水溶性的某些水溶性的非离子型高分子聚合物非离子型高分子聚合物是是2020世纪世纪6060年代发展起来的沉淀剂，近年来被广泛用于核年代发展起来的沉淀剂，近年来被广泛用于核酸、蛋白质和酶的分离纯化，包括不同分子量的酸、蛋白质和酶的分离纯化，包括不同分子量的聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、聚乙烯吡咯烷酮（）、聚乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）和葡）和葡聚糖聚糖等。等。应用最多的是应用最多的是PEGPEG，原因：无毒，对成品影响，原因：无毒，对成品影响小小 （1 1）用水溶性非离子聚合物沉淀生物大分子和）用水溶性非离子聚合物沉淀生物大分子和颗粒的两种方法：颗粒的两种方法：选用选用两种两种水溶性非离子多聚物组成水溶性非离子多聚物组成液液-液两液两相系统相系统，使生物大分子或颗粒在，使生物大分子或颗粒在两相系统两相系统中不等中不等量分配，进行分离。量分配，进行分离。机理：不同生物分子和颗粒表面结构不同，有机理：不同生物分子和颗粒表面结构不同，有不同分配系数；且外加离子强度、不同分配系数；且外加离子强度、pHpH和温度等的和温度等的影响，提高分离效果。影响，提高分离效果。选用选用一种一种水溶性非离子多聚物，使生物大分水溶性非离子多聚物，使生物大分子或颗粒在子或颗粒在同一液相同一液相中，由于被排斥相互凝集而中，由于被排斥相互凝集而沉淀析出。沉淀析出。（2 2）PEGPEG的沉淀的沉淀 机理机理 劳兰梯提出：通过空间位置排斥，使液体中的劳兰梯提出：通过空间位置排斥，使液体中的生物大分子、病毒和细菌等微粒被迫挤聚在一起生物大分子、病毒和细菌等微粒被迫挤聚在一起而引起沉淀的发生。而引起沉淀的发生。影响因素影响因素 PEGPEG浓度：浓度：PEGPEG相对分子质量：相对分子质量：离子强度：离子强度：蛋白质相对分子质量：蛋白质相对分子质量：pHpH：温度：温度：与溶液中盐的浓度成反比与溶液中盐的浓度成反比越接近蛋白质的越接近蛋白质的pIpI，所需，所需PEGPEG浓度越低浓度越低高分子量高分子量的的PEGPEG沉淀效果较好沉淀效果较好分子量越高，分子量越高，PEGPEG越少越少 优缺点优缺点 优点：无毒，对成品影响小，所以广泛用于核优点：无毒，对成品影响小，所以广泛用于核酸、蛋白质、酶等的沉淀分离。酸、蛋白质、酶等的沉淀分离。缺点：所得沉淀中含有大量缺点：所得沉淀中含有大量PEGPEG去除蛋白质去除蛋白质沉淀中的沉淀中的PEGPEG吸附法吸附法乙醇沉淀法乙醇沉淀法盐析法盐析法吸附法吸附法沉淀物溶于沉淀物溶于磷酸缓冲液磷酸缓冲液用用DEAE-纤维素纤维素离子交换剂吸附离子交换剂吸附蛋白质蛋白质蛋白质再用蛋白质再用KCl洗脱洗脱透析脱盐透析脱盐PEG不被吸不被吸附而除去附而除去乙醇沉淀法乙醇沉淀法沉淀物溶于沉淀物溶于磷酸缓冲液磷酸缓冲液用用20%乙醇乙醇沉淀蛋白质沉淀蛋白质离心（离心（PEG留留在上清液）在上清液）盐析法盐析法沉淀物溶于沉淀物溶于磷酸缓冲液磷酸缓冲液用用35%硫酸铵硫酸铵沉淀蛋白质沉淀蛋白质PEG留在留在上清液上清液 4.4.选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法 破坏杂质，保存目的物。破坏杂质，保存目的物。原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，从而有选对某些物理或化学因素敏感性不同，从而有选择的使之变性沉淀，分离纯化。择的使之变性沉淀，分离纯化。表面活性剂或有机溶剂引起变性表面活性剂或有机溶剂引起变性利用对热的稳定性不同利用对热的稳定性不同酸碱变性酸碱变性 利用表面活性剂或有机溶剂变性。利用表面活性剂或有机溶剂变性。如：制备核酸时，加入含水酚、氯仿、如：制备核酸时，加入含水酚、氯仿、SDSSDS等等选择性的使蛋白质变性沉淀，从而与核酸分离。选择性的使蛋白质变性沉淀，从而与核酸分离。利用对热的稳定性不同，加热破坏某些组利用对热的稳定性不同，加热破坏某些组分，保留另一些组分。分，保留另一些组分。如如 热稳定性热稳定性:DNase RNase:DNase RNase，加热可使，加热可使DNaseDNase变性沉淀。变性沉淀。简单可行，制备热稳定的小分子物质过程中，简单可行，制备热稳定的小分子物质过程中，对于除去大分子蛋白质和核酸有效。对于除去大分子蛋白质和核酸有效。选择性的酸碱变性选择性的酸碱变性 如：用如：用2.5%2.5%的的TCATCA处理胰蛋白酶、抑肽酶或细处理胰蛋白酶、抑肽酶或细胞色素胞色素c c的粗提液，均可除去大量杂蛋白，而对的粗提液，均可除去大量杂蛋白，而对所提取的酶活性无影响。所提取的酶活性无影响。有时把酸碱变性和热变性结合起来，效果更好有时把酸碱变性和热变性结合起来，效果更好 沉沉淀淀分分离离法法课堂总结课堂总结盐析沉淀法盐析沉淀法有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀等电点沉淀法等电点沉淀法成盐沉淀法成盐沉淀法高分子聚合物沉淀高分子聚合物沉淀选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法原理、无机盐的选择（原理、无机盐的选择（(NH(NH4 4)2 2SO4SO4）、）、影响因素（影响因素（5 5个）、优缺点个）、优缺点原理、常用（甲醇、原理、常用（甲醇、乙醇乙醇、异丙醇、异丙醇、丙酮）、影响因素（丙酮）、影响因素（4 4个）、优缺点个）、优缺点原理、使用时注意事项原理、使用时注意事项金属离子沉淀法：金属离子沉淀法：3类类有机酸沉淀法：常用有机酸有机酸沉淀法：常用有机酸无机酸沉淀法：常用无机酸无机酸沉淀法：常用无机酸常用沉淀剂、影响常用沉淀剂、影响PEGPEG沉淀效果沉淀效果的因素、如何去除沉淀中的的因素、如何去除沉淀中的PEGPEG3 3种方法种方法课后题课后题1.1.使用等电点沉淀法、成盐沉淀法和选择性变性使用等电点沉淀法、成盐沉淀法和选择性变性沉淀法各应注意什么问题沉淀法各应注意什么问题?2.PEG2.PEG沉淀效果的影响因素有哪些？如何去除蛋沉淀效果的影响因素有哪些？如何去除蛋白质沉淀中的白质沉淀中的PEG?PEG?此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢