小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶载体的构建

小鼠锌指卵白基因Znf230条件基因打靶载体的构建刘英，刘运强，周钦，陶大昌，彭艳，刘合【关键词】,DNA结合基因卵白质类；,基因；,聚合酶链反响；,克隆,分子摘要:目的构建用于小鼠锌指卵白基因Znf230条件基因打靶的载体，为产生Znf230基因敲除的小鼠模子预备条件。要领方案和合成引物，经PR从小鼠的基因组中扩增出5同源臂、3同源臂及锚定序列，长度别离为4，4，1kb的片断，反向插入pBS载体的ne基因的两侧，从而构建小鼠Znf230条件基因打靶载体Znf230pBS(5)。效果颠末限定性内切酶及DNA测序断定，证明该条件基因打靶载体含有的同源序列与Genebank宣布的基因序列同等，表白载体构建乐成。结论PR技能和定向克隆技能是构建条件基因打靶载体简朴而可靠的要领。运用该技能可得到小鼠锌指卵白基因Znf230的条件基因打靶载体。关键词:DNA结合基因卵白质类；基因；聚合酶链反响；克隆，分子已婚育龄匹俦不孕不育症的发病率约10%15%，此中50%由男性不育引起。导致男性不育的因素许多,除体系疾并营养不良、内排泄疾并精子运送的剖解学上停滞、熏染、情况毒物等外，精子产生停滞为一个紧张缘故原由,表示为无精子症或少精子症(精子数2106L-1)。导致无精症的缘故原由不详，更无有用的治疗要领。为探究其发病机制，相识疾病的干预因素，必需具有精良的动物模子。基因打靶技能是比年来敏捷生长起来的新兴分子生物学技能,对胚胎干细胞(ebryniste,ES)举行基因打靶是报酬特定地修饰和改革细胞染色体遗传性状的有用要领和途径1。re/LxP体系的引入使从时间和空间操纵基因的敲除成为大概，有用的制止了胚胎发育紧张基因敲除后胚胎不克不及存活、从而无法举行后续研究的限定23。条件敲除载体的构建是举行条件基因打靶关键的第一步。一样平常利用更换型打靶载体,在锚定序列的两侧插入同向的LxP序列和外源性同源序列及正挑选标识表记标帜基因。正挑选标识表记标帜基因位于内含子中，可以帮助研究者挑选担当了外源基因的细胞，但不影响细胞和团体的正常成效。笔者实验运用该法创立Znf230基因敲除的小鼠模子，第一步事情就是利用re/LxP体系构建条件基因打靶载体。1质料和要领1.1质料限定性内切酶、T4DNA毗连酶购自美国纽英伦公司；高保真Taq酶(PlatinuTaqDNAPlyeraseHighFidelity)和T载体(TPTAlningKit)购自美国Invitrgene公司；pBlueSript质粒购自美国STRATAGENE公司。胶接纳试剂盒(QIAquikGelExtratinKit)购自德国QIAGEN公司。质粒小量抽提试剂盒购自北京百泰克生物技能公司。所用引物由上海申能博彩生物科技合成；测序由上海英骏生物技能完成。1.2引物方案F1：5ATAGGTGTTTGTTTTTTTTT3R1：5GGTAGTGTTAATAAAATAG3用来扩增5同源臂，并引入酶切位点lu和Nhe。F2：5ATGAGTTGAGTTGGGTTTATT3R2：5TGAATTGGTTGAGAATAGAGGGATGG3用来扩增3同源臂，并引入酶切位点Sa和fe。F3:5AAGTGAGGATGTGTGTTTGGTAG3R3:5ATGTAAGGATAGGAAGGAATAAA3用来扩增锚定序列，并引入酶切位点Sal和Bpu10。F4:5GATTATGGGATAATTGTATAGATA3R4:5GAATGAGATAATTGTATAATGTATG3用来扩增带有同向LxP序列的锚定序列，并引入酶切位点Psp和Xh。1.33同源臂的克隆1.45同源臂的克隆1.5锚定序列克隆2效果2.1PR扩增用特异性引物F1和R1、F2和R2、1和5:DNA分子量标识表记标帜;2:3同源臂;3,4和8:阴性比拟;6和7:5同源臂;9:锚定序列;10:DNA分子量标识表记标帜.图1同源臂及锚定序列经PR扩增后电泳略Fig1EletrphresisfthehlgusarsandthetargetingsequeneaplifiedbyPR1,2和3:Nhe酶切断定hZnf230pBS(3);4和5:DNA分子量标识表记标帜;6和7:Nhe酶切断定hZnf230pBS(5);8:Nhe酶切断定hZnf230pBS(4).图2限定性内切酶酶切断定小鼠Znf230基因打靶载体略Fig2REaseanalysisftheuseZnf230genetargetingvetrF3和R3、F4和R4举行PR扩增，均得到特异性PR产物，所得PR产物别离为4，4，1，1.1kb，片断长度和预期同等图1。2.5克隆片断的DNA序列阐发条件基因打靶载体上的3同源臂克垄5同源臂克隆和锚定序列克隆的测序事情是按照Genebank宣布的基因序列方案引物，举行双向测序，测序事情由上海英骏生物技能完成。测序效果与Genebank宣布的基因序列比拟力，5同源臂包罗外显子，锚定序列包罗外显子，外显子及其上卑劣300bp范畴内到达100%同等，别的地区到达99%同等。3讨论Znf230是本室于2001年运用RNA差异表现法从正常婚育男性的睾丸构造中新克隆的基因，位于11p15，共有2个转录本，此中1kb的转录本在除外睾丸构造的成年人其他各脏器构造均无表达，在无精症患者的睾丸构造中也无表达4。在小鼠中有3个转录本，此中1kb的转录本也只在小鼠的睾丸构造表达。研究创造，Znf230开始表达于小鼠出生后6d的睾丸构造，1421d到达成年程度。该阶段是精子产生的紧张时期，圆形精子开始出如今生精小管，据此推测其大概作为睾丸特异性转录因子在精子产生历程中发挥作用5。本研究以pBS为载体,构建小鼠Znf230基因的条件打靶载体,颠末PR、酶切断定,以及序列阐发证明打靶载体构建乐成。在构建Znf230pBS时，运用高保真Taq酶举行长链PR扩增，接纳了热启动的方法，将循环次数操纵在30次，对重组片断举行序列阐发,同时接纳定向克隆法以包管载体上插入同源臂的序列及标的目的的准确性，制止了通常构建基因打靶载体时挑选含有目的片断的阳性克隆的庞大与繁琐。在选择打靶位点时，笔者选择第三外显子作为锚定序列，在该外显子被敲除后由于移码突变作用导致停顿暗码提早出现，第三外显子后的别的3个外显子均无法表达，从而使该基因的紧张成效域环指布局无法表达，基因成效丧失。本研究将同源臂及锚定序列以相反标的目的插入正挑选标识表记标帜ne基因的两侧，制止了ne基因的强启动子启动卑劣外显子的表达，翻译出截短的蛋鹤发挥部门成效。基因打靶服从的凹凸与打靶载体中同源臂的长度呈正相干,增长了同源臂的长度，使打靶载体Znf230pBS中同源臂总长度为8kb(各4kb),有利于进步重组服从。保存了高效切割的限定性内切酶luI,作为基因打靶时举行载体DNA线性化位点，从而进步同源重组的服从6。本研究得到的条件基因更换型打靶载体Znf230pBS，为下一步创立无精症小鼠模子奠基基矗参考文献：1ThasKR,apehiR.SitediretedutagenesisbygenetaruetinginuseebrynisteellsthrughhlgusrebinatinithisgeniDNAnstrutsJ.ell,1987,51(3):503512.2GuH,arthJD,rbanP,etal.DeletinfaDNAplyerasebetagenesegentinTellsusingelltypespeifigenetargetingJ.Siene,1994,265(5168):103106.3杨晓,黄培堂,黄翠芬.在小鼠举行基因打靶的研究希望J.科学转达,2000,45(15):1584.4ZhangSZ,Qiu,uH,etal.TheshrterzinfingerprtEinZNF230geneessageistransribedinfertilealetestesandayberelatedthuansperatgenesisJ.Bihe,2001,359(PT3):721727.5Qiu,ZhangS,Xia,etal.leularlningandharaterizatinfausesperatgenesisrelatedringfingergeneznf230J.BiheBiphysResun,2022,306(2),34753.6.ullerU.Tenyearsfgenetargeting:targeteduseutants,frvetrtphentypeanalysisJ.ehDev,1999,82(12):321.